干旱脅迫及復(fù)水對(duì)M9T337蘋果砧木苗生理特性的影響

趙文哲，劉曉，杜桂英，鄧文鵬，宋新衛(wèi)，肖偉，李玲

（1.作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心/山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.五蓮縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 五蓮 276800；3.肥城市新城街道辦事處，山東 肥城 271600）

世界上有30%以上的土地處于干旱和半干旱地區(qū)，其他地區(qū)由于氣候的不同也出現(xiàn)了季節(jié)性干旱［1］。我國(guó)北方自然降水少，農(nóng)業(yè)用水不足，已成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素。果樹生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成受水分影響很大，而我國(guó)北方落葉果樹種植區(qū)往往無灌溉條件或者灌溉條件較差，嚴(yán)重影響果樹產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)，干旱脅迫已成為影響北方果樹生產(chǎn)的重要環(huán)境因子［2］。

在遭受干旱脅迫時(shí)，植物體會(huì)進(jìn)行一系列生理生化調(diào)節(jié)來抵御水分脅迫對(duì)自身的傷害［3］。Redillas等研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下存在葉綠素含量先升高后下降的現(xiàn)象［4］，這可能有助于提高脅迫初期植株的捕光能力，促進(jìn)光合機(jī)構(gòu)的能量連通性，在一定程度上防御PSⅡ發(fā)生光抑制［5］。光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）的變化可以反映光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)活性及植物的光能利用效率，在干旱脅迫條件下三者均下降，脅迫程度越嚴(yán)重下降越顯著［6］。滲透調(diào)節(jié)是植物抵御逆境脅迫的重要方式之一，其主要表現(xiàn)是細(xì)胞內(nèi)滲透勢(shì)的下降和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累［7］。干旱脅迫下，植物體內(nèi)可以積累大量的游離脯氨酸以增強(qiáng)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，游離脯氨酸含量與植物的抗旱性呈正相關(guān)關(guān)系，可作為植物抗旱性評(píng)價(jià)的指標(biāo)；另外，干旱脅迫強(qiáng)度直接影響植物可溶性蛋白含量的變化，脅迫強(qiáng)度越大，其積累越明顯［8］。

蘋果（Malus domestica）是薔薇科蘋果屬多年生木本植物，為落葉喬木，主要通過嫁接進(jìn)行繁殖，因此，砧木對(duì)逆境的適應(yīng)性直接影響嫁接蘋果品種的適應(yīng)能力。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)‘嘎啦’嫁接到抗旱砧木上時(shí)，其水分利用率明顯提高［9］。因此，在干旱、半干旱地區(qū)，選用較為抗旱的砧木嫁接蘋果品種，可使其更好地適應(yīng)缺水環(huán)境［10］。

M9T337是荷蘭木本植物苗圃檢測(cè)服務(wù)中心選育出來的脫毒M9矮化砧木優(yōu)系，比M9砧木矮化程度高20%［11］。本試驗(yàn)即以蘋果砧木M9T337為試材，從葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、根系活力、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等角度研究該砧木對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)，以期為砧木抗旱性評(píng)價(jià)體系的建立和高效抗旱砧木資源的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年6—10月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。選取生長(zhǎng)狀況良好且樹勢(shì)基本一致的一年生M9T337蘋果砧木苗進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年6 月中旬將所選一年生M9T337蘋果砧木苗移栽入上口徑34 cm、下底徑19 cm、高23 cm的塑料盆中，盆栽土壤為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果中心園土，每處理25盆，每盆4株，每處理共100株；8月中旬將試材移入避雨棚內(nèi)進(jìn)行持續(xù)干旱處理，以正常供水為對(duì)照；脅迫第18天，供試植株葉片出現(xiàn)萎蔫時(shí)，進(jìn)行復(fù)水處理，澆透水。

分別于干旱處理的第0、6、12、18、24天測(cè)定新梢中部功能葉片熒光參數(shù)，并取樣，每次隨機(jī)取15株，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫煌瑫r(shí)取土樣進(jìn)行土壤含水量測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 采用英國(guó)Hansatech公司的FMS-2型便攜脈沖調(diào)制式熒光儀測(cè)定M9T337砧木葉片光適應(yīng)下的穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）、最大熒光（Fm′）、最小熒光（Fo′），充分暗適應(yīng)20 min后測(cè)量葉片的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）和PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm。通過公式計(jì)算得到PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量（ΦPSⅡ）和光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）。qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），ФPSⅡ=（Fm′-Fs）/Fm′。

1.3.2 葉綠素含量 采用分光光度法測(cè)定。取新鮮葉片0.2 g于離心管中，加95%乙醇20 mL浸泡，用鋁箔紙將離心管包住后置于黑暗條件下24～36 h至葉片發(fā)白，取出于663、646、470 nm下比色（以95%乙醇為對(duì)照）。重復(fù)3次。

1.3.3 根系活力 采用氯化三苯基四氮唑還原法（TTC法）進(jìn)行測(cè)定［12］，結(jié)果用單位鮮重根系還原量表示。

1.3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定，淀粉含量采用酸水解法測(cè)定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）法測(cè)定［13］。

1.3.5 相對(duì)電導(dǎo)率 使用電導(dǎo)率儀測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。鮮樣用自來水沖洗后取0.5 g，加入20 mL蒸餾水，抽氣3次，每次20 min，取出搖動(dòng)，室溫保持3～4 h，測(cè)電導(dǎo)率S1；封口沸水浴10 min，冷卻，平衡10 min后測(cè)S2，同時(shí)測(cè)定蒸餾水S0，根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率：相對(duì)電導(dǎo)率（%）=100×（S1-S0）/（S2-S0）。

1.3.6 半胱氨酸蛋白酶（Casp）活性 參照文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行測(cè)定。稱鮮葉樣約1 g在液氮中充分研磨，加入1×PBS（pH 7.2～7.4）9 mL勻漿，然后2500 r/min離心30 min，取上清，用Plant Casp ELISA Kit試劑盒進(jìn)行半胱氨酸蛋白酶活性測(cè)定，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用GraphPad Prism 6作圖，采用IBM SPSS Statistics 21對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片葉綠素含量的影響

如圖1所示，干旱脅迫能夠促進(jìn)M9T337砧木葉片中葉綠素的積累，干旱脅迫第12天時(shí)，葉綠素含量最高，顯著高于對(duì)照31.5%，此時(shí)土壤含水量為8%左右；干旱脅迫第18天的葉綠素含量次之，也顯著高于對(duì)照；其余時(shí)間干旱處理的葉綠素含量與對(duì)照差異不顯著。復(fù)水第6天的葉綠素含量較干旱脅迫第18天低，但仍高于對(duì)照，差異未達(dá)顯著水平。

圖1 干旱及復(fù)水過程中M9T337蘋果砧木葉片的葉綠素含量

2.2 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片熒光參數(shù)的影響

自然干旱過程中M9T337蘋果葉片光適應(yīng)下的最大熒光Fm′逐漸下降，脅迫第18天時(shí)最低，比對(duì)照低41.0%；復(fù)水后Fm′快速上升，至復(fù)水第6天時(shí)已基本恢復(fù)到未進(jìn)行干旱脅迫時(shí)的值（圖2A）。干旱脅迫6天后，光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）和PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）快速下降，第18天時(shí)值最低，與對(duì)照相比分別降低了53.1%和48.8%；復(fù)水后逐漸恢復(fù)，至復(fù)水第6天時(shí)已接近脅迫第6天的值（圖2 B、C）。干旱脅迫與復(fù)水過程中PSⅡ最大光化學(xué)效率除在干旱12天時(shí)略有降低外，其余時(shí)間變化很小，與對(duì)照相比差異不大（圖2D）。

圖2 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337砧木葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.3.1 對(duì)可溶性糖含量的影響 由圖3可以看出，干旱脅迫12天后M9T337砧木葉片中可溶性糖含量上升，第12、18天分別比對(duì)照高12.51%和49.93%，第18天時(shí)顯著高于對(duì)照。復(fù)水后其含量明顯下降，復(fù)水第6天的可溶性糖含量顯著低于對(duì)照，降幅為38.37%。

圖3 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片可溶性糖含量的影響

2.3.2 對(duì)淀粉含量的影響 如圖4所示，干旱脅迫顯著降低M9T337葉片中的淀粉含量，尤其脅迫第12、18天時(shí)大幅下降，分別比對(duì)照降低85.4%和92.5%。復(fù)水后淀粉含量上升很快，第6天時(shí)淀粉含量?jī)H比對(duì)照低6.8%，差異不顯著。

圖4 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片淀粉含量的影響

2.3.3 對(duì)可溶性蛋白含量的影響 由圖5可見，干旱脅迫顯著提高M(jìn)9T337葉片中的可溶性蛋白含量，且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，第18天時(shí)可溶性蛋白含量達(dá)到最高值，是對(duì)照的3.7倍。復(fù)水后又快速下降，至復(fù)水第6天時(shí)與對(duì)照相當(dāng)。

圖5 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片可溶性蛋白含量的影響

2.4 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖6可知，干旱脅迫12天內(nèi)，M9T337的相對(duì)電導(dǎo)率變化較小，與對(duì)照差異不顯著，但之后迅速上升，第18天時(shí)達(dá)到對(duì)照的2.53倍。復(fù)水后相對(duì)電導(dǎo)率又明顯下降，復(fù)水第6天時(shí)與對(duì)照差異不大。

圖6 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.5 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片半胱氨酸蛋白酶活性的影響

如圖7所示，M9T337蘋果砧木葉片中的半胱氨酸蛋白酶活性在干旱及復(fù)水過程中變化較小，干旱18天時(shí)略有降低，復(fù)水后又逐漸恢復(fù)，與對(duì)照差異不顯著。

圖7 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木 葉片半胱氨酸蛋白酶活性的影響

2.6 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木根系生長(zhǎng)的影響

2.6.1 對(duì)根系形態(tài)的影響 如圖8所示，干旱脅迫6 d內(nèi)，植株細(xì)根較多且大多鮮嫩富有活力；脅迫第12天時(shí)，植株根部出現(xiàn)木質(zhì)化；脅迫第18天時(shí)根系木質(zhì)化嚴(yán)重，褐化，細(xì)根少；復(fù)水6 d時(shí)的根系形態(tài)變化不明顯。

圖8 干旱及復(fù)水過程中M9T337蘋果砧木苗根系形態(tài)

2.6.2 對(duì)根系活力的影響 如圖9所示，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，M9T337砧木苗根系活力呈下降趨勢(shì)，且在干旱6天后快速下降，干旱第12天的根系活力較對(duì)照下降67.5%，第18天接近于零。復(fù)水后M9T337砧木苗根系活力有所回升，但第6天時(shí)仍顯著低于對(duì)照，約是對(duì)照的1/2。

圖9 干旱及復(fù)水過程中M9T337蘋果砧木苗的根系活力

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱及復(fù)水過程中M9T337蘋果砧木葉片葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

王斌等研究表明光合和葉綠素?zé)晒鈪?shù)可作為評(píng)價(jià)木本植物抗旱性的有效指標(biāo)［15］。葉綠素含量高低可以反映植物的光合作用能力強(qiáng)弱，而葉綠素?zé)晒庾兓梢栽谝欢ǔ潭壬戏从抄h(huán)境因子對(duì)植物光合作用的影響［16］。逆境條件下，葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)受到影響，會(huì)降低光系統(tǒng)（尤其PSⅡ）的活性，導(dǎo)致光系統(tǒng)對(duì)能量吸收、捕獲和轉(zhuǎn)換的能力降低，非光化學(xué)耗散比率增加［17］。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫能增加M9T337葉片的葉綠素含量，至脅迫第12天時(shí)顯著高于對(duì)照，達(dá)到最高值，第18天時(shí)稍有降低，仍顯著高于對(duì)照；復(fù)水后的葉綠素含量高于對(duì)照，但與對(duì)照差異不顯著。干旱脅迫能夠降低植物的光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）、光適應(yīng)下最大熒光（Fm′）和PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率（ΦPSⅡ），說明干旱脅迫使PSⅡ反應(yīng)中心活性及光化學(xué)反應(yīng)能力下降；但PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）與對(duì)照差異較小，說明干旱脅迫對(duì)M9T337蘋果砧木苗的最大光能轉(zhuǎn)換效率影響較小。

3.2 干旱及復(fù)水處理對(duì)M9T337蘋果砧木葉片細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的影響

滲透調(diào)節(jié)在植物對(duì)逆境的適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用［18］。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白等的積累能降低滲透勢(shì)，減輕逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞的傷害，維持細(xì)胞內(nèi)代謝的正常進(jìn)行［19，20］。淀粉是葡萄糖分子的高聚體，是植物體內(nèi)主要的碳素貯藏物質(zhì)，占有較高的比例。

本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫能增加M9T337砧木葉片中的可溶性蛋白和可溶性糖含量，降低淀粉含量，尤其脅迫6天后變化更為劇烈，但復(fù)水均能扭轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)，使三者含量趨于正常。干旱脅迫下葉片中淀粉含量普遍降低，原因可能是一部分被淀粉酶降解，另一部分則水解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，從而增加可溶性糖的累積。

蛋白質(zhì)在細(xì)胞生理代謝過程中有重要的催化功能，其含量在一定程度上能夠反映植物內(nèi)部代謝的活躍程度［21，22］。半胱氨酸蛋白酶作為蛋白水解酶，能夠降解逆境條件下的受損蛋白，為新蛋白的合成提供肽段或游離的氨基酸，而且存在于葉綠體中的半胱氨酸蛋白酶可以降解光合和光呼吸中的重要酶RuBisCO［14］。在本試驗(yàn)條件下，干旱和復(fù)水對(duì)M9T337葉片中的半胱氨酸蛋白酶影響較小，僅在干旱脅迫第18天時(shí)略有下降。通過分析相對(duì)電導(dǎo)率的變化，僅在處理第18時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率大幅升高，其余時(shí)間基本在正常水平。表明，在本試驗(yàn)的自然干旱處理時(shí)段內(nèi)，M9T337受傷害的程度較輕，及時(shí)復(fù)水可有效幫助植株恢復(fù)正常生理代謝。

3.3 干旱及復(fù)水過程中M9T337蘋果砧木根系的變化

本研究發(fā)現(xiàn)，短時(shí)干旱脅迫未對(duì)M9T337根系形態(tài)產(chǎn)生明顯影響，但脅迫12天后，根系木質(zhì)化逐漸加重，細(xì)根明顯減少，根系活力顯著降低。表明長(zhǎng)時(shí)間干旱可明顯影響根系的吸收能力，進(jìn)而影響植株生理代謝。

綜合本研究結(jié)果，停止?jié)菜?8天能對(duì)M9T337蘋果砧木苗的根系活力和葉片生理代謝產(chǎn)生一定影響，時(shí)間越長(zhǎng)影響越明顯，但及時(shí)復(fù)水可在一定程度上緩解干旱對(duì)其的傷害。