含ACC脫氨酶的根際促生菌對切花月季生長及生理的影響

李文祥，張天謠，賈顏，劉松，李茜，倪功，黃海泉，黃美娟

（1.西南林業大學園林園藝學院/國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心/云南省功能性花卉資源及產業化技術工程研究中心/西南林業大學園林園藝花卉研發中心，云南 昆明 650224；2.云南錦苑花卉產業股份有限公司，云南 石林 652208）

切花月季（Rosa hybrida）為薔薇科薔薇屬常綠、半常綠花卉，作為世界四大鮮切花之一備受消費者喜愛，具有良好的觀賞和經濟價值。‘伊芙伯爵’作為切花月季品種，具有花量多、花朵大、花型美、重瓣性強的特點，并帶有濃濃的老玫瑰花香，深受人們的喜愛，但其生長速度相對較慢，目前生產實踐中常通過大量施用化肥、農藥來提高其產量和品質，久而久之易造成土壤板結、養分失衡和環境污染等問題，不僅影響切花月季的產量和品質，而且對人類健康及生存環境構成極大的威脅［1］，生產過程中兼顧生態效益對于該產業可持續發展具有重要意義。對根際生態中的植物-土壤-微生物互作過程的研究發現，植物根際促生菌在促進植物生長的同時，還能夠改良土壤中的微生態環境，因此不僅能提高作物產量及品質，而且有利于減少化肥、農藥等的施用［2］，降低生產成本及環境污染。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是對植物根際有益微生物的統稱，能與植物相互作用，從而改善植物生長［3-6］。其中，含ACC（1-氨基環丙烷羧酸）脫氨酶的PGPR可分解ACC（乙烯合成直接前體）［7］，減少乙烯生成，延緩植物衰老，在干旱、重金屬等逆境條件下能顯著提高農作物的抗逆性和產量。如宋金秋等［8］從絞股藍種植土壤中分離到7株具ACC脫氨酶活性的細菌，其中表現最優的菌株可使水稻幼苗的根長提高1.6倍，根鮮重增加。Khalifa等［9］在鹽生植物根際分離出兩面神菌屬、芽孢桿菌屬和枯草芽孢桿菌屬共3株產ACC脫氨酶菌株，接種小麥后均能顯著促進其生長。Santana等［10］發現接種根際促生菌芽孢桿菌能緩解干旱導致的高粱光合速率降低。然而，目前尚未見將含ACC脫氨酶的PGPR應用于切花月季栽培中的研究報道。本研究以市場上熱銷的切花月季栽培品種‘伊芙伯爵’為材料，研究具有ACC脫氨酶活性的PGPR對其生長及生理指標的影響，篩選出對其有促生作用的菌株，從而為切花月季環境友好型生物菌肥的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用菌株為本實驗室前期分離篩選到的具ACC脫氨酶活性的7株菌，具體信息見表1。長勢一致的‘伊芙伯爵’切花月季扦插苗由云南錦苑花卉產業股份有限公司提供，苗高約10 cm。

表1 含ACC脫氨酶的菌株信息

1.2 試驗設計

1.2.1 菌懸液制備 挑取ADF固體培養基（ACC為唯一氮源）中的單菌落接種于TSB液體培養基，28℃、200 r/min振蕩培養至OD600nm為0.5后于4℃、8000 r/min離心15 min，收集菌體，并以原體積無菌水重懸，得到單菌的菌懸液。混合菌液為7種單菌菌懸液以等比例混合而成。

1.2.2 試驗設計 將多菌靈原粉按8～10 g/m2的比例拌入栽培基質（草炭土、黃土、珍珠巖以10∶3∶2比例混合而成）中進行消毒殺菌，并晾曬3天，采用無紡布種植袋（35 cm×30 cm）種植月季扦插苗，緩苗一個月后，對其根部進行菌懸液澆灌處理，設置單菌F195組、F105組、F11組、F23組、L11組、L74組、Z22組及混合菌液Mix組8個處理，每袋澆灌50 mL菌懸液與800 mL無菌水，以純無菌水澆灌作為對照（CK），每個處理4株，重復3次。

1.3 測定指標及方法

于菌懸液處理第60天，測量月季株高、莖粗、分枝數、花徑、葉綠素相對含量（SPAD）、葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量和花朵乙烯釋放量（ethylene production，EP），并對光合作用指標和葉綠素熒光參數進行測定。

1.3.1 SOD、POD、CAT活性和MDA含量的測定 參考高俊鳳［11］的方法測定。

1.3.2 SPAD及葉綠素熒光的測定 選取上、中、下部葉片，使用葉綠素儀（SPAD 502，精度0.1 SPAD）測定葉綠素相對含量。利用調制葉綠素熒光成像系統（IMAGING-PAM，S/N：IKEB0261，IMAG-CM，德國）在葉片暗適應30 min后，測定初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、實際光化學效率（ΦPSⅡ）、非光化學淬滅系數（qN）、光化學淬滅系數（qP）和表觀光合電子傳遞效率（ETR），并計算最大光化學效率（Fv/Fm）。

1.3.3 葉片光合特性的測定 采用LI-6400 XT便攜式光合作用測定系統（內置專用紅藍光源葉室）在晴天9∶00—11∶30及15∶30—17∶00選擇植株頂部生長點向下第3～5片功能葉測定氣孔導度（Gs）、凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），并計算水分利用效率（Pn/Tr）。

1.3.4 花朵乙烯釋放量的測定 利用便攜式乙烯分析儀CI-900測定單朵花在5 min內的乙烯釋放量。

1.4 數據統計分析

數據用SPSS 26.0進行統計分析，用Duncan’s法進行多重比較（α=0.05），用Microsoft Excel 2019作圖。

2 結果與分析

2.1 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’主要農藝性狀的影響

如表2所示，所有菌株處理的月季株高均顯著高于對照，以F195菌株處理的最高，達68.1 cm，較對照增加56.91%，菌株F105處理的次之，L11菌株處理的最低，但仍高于對照23.73%。除Z22菌株處理的月季莖粗顯著低于對照外，其余菌株處理的莖粗均與對照差異不顯著，僅F23處理的莖粗略高于對照。除F105和F11外，各菌株處理的分枝數均略高于對照，但未達差異顯著水平，其中混合菌株處理的分枝數最多，顯著高于F105處理。各菌株處理的花徑均與對照無顯著差異，僅F23菌株處理的略大于對照。可見，含ACC脫氨酶的各菌株能夠顯著促進月季‘伊芙伯爵’的株高增長，但對莖粗、分枝數和花徑的影響較小。

表2 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’主要農藝性狀的影響

2.2 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’葉片MDA含量及葉綠素相對含量的影響

PGPR菌株處理能降低‘伊芙伯爵’葉片的MDA含量，提高葉綠素相對含量（圖1）。混合菌株處理對MDA含量的降低幅度最大，F23和F195次之，分別為對照的63.58%、72.52%和77.32%，差異達顯著水平。各單菌處理能增加葉片中的葉綠素含量，其中F195菌株處理的SPAD值顯著高于對照12.87%，而混合菌株處理的SPAD值略降低，但與對照差異不顯著。

圖1 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’葉片MDA含量及葉綠素相對含量的影響

2.3 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’花朵乙烯釋放量與葉片抗氧化酶活性影響

從圖2可以看出，混合菌株和單菌Z22處理能夠促進‘伊芙伯爵’花朵的乙烯釋放，但與對照差異不顯著；其余菌株處理均能減少花朵的乙烯釋放量，尤以F195菌株處理的減幅最大，乙烯釋放量僅為對照的64.54%。除L11和Z22菌株處理略降低SOD活性外，各單菌和混合菌株處理均能提高月季葉片的抗氧化酶活性，其中，F195菌株處理的SOD、POD、CAT活性分別顯著高出對照38.64%、58.45%、1.17倍，F11菌株的SOD活性顯著高出對照42.03%，其余菌株處理均與對照差異不顯著。

圖2 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’花朵乙烯釋放量及葉片抗氧化酶活性的影響

2.4 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’光合特性的影響

從表3可以看出，相比于對照和各單菌處理，混合菌株處理降低了‘伊芙伯爵’葉片的Pn、Gs、Ci和Tr，與對照差異達顯著水平。各單菌處理中，與對照相比，F11菌株顯著提高了Pn，達到對照的1.07倍，而F105、F23、L74、Z22均顯著降低了Pn；F195菌株處理顯著提高了Gs，達到對照的2.15倍；F195、F105、F11、F23菌株處理顯著提高了Ci，分別是對照的1.25、1.17、1.19、1.25倍，其余菌株處理與對照差異不顯著；F195、F11、F23顯著提高了Tr，分別高于對照75.8%、49.5%、24.2%，而其余菌株處理均顯著降低了Tr。菌株L11和混合菌株顯著提高了‘伊芙伯爵’的水分利用效率，增幅分別為50.0%和42.6%，而F195、F11、F23菌株處理的水分利用效率均顯著低于對照，其余菌株處理則與對照差異不顯著。

表3 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’光合特性的影響

2.5 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’葉綠素熒光特性的影響

從表4可以看出，與對照相比，施入不同PGPR單菌或混合菌對月季葉片的Fv/Fm、qP無顯著影響，但顯著降低ΦPSⅡ；除F195菌株處理的qN外，PGPR處理降低qN和ETR，其中L11和Mix的qN顯著低于對照，除F195、F23、L74外的其余菌株處理ETR均顯著低于對照。綜合來看，菌株處理后，各熒光參數均沒有顯著高于對照，表明PGPR菌株處理對光合作用的提高可能并不直接來源于對葉綠素熒光特性的改善，而是存在其他機制。

表4 含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株對‘伊芙伯爵’葉綠素熒光特性的影響

3 討論與結論

植物與存在于其生活環境中的微生物有著緊密聯系，長久的進化使其在植物生長和逆境適應中扮演著不可或缺的角色。已有研究揭示，PGPR存在多個機制刺激植物生長，包括能進行生物固氮作用［12，13］、合成激素（IAA、GA3以及細胞分裂素等）［14］、對抗病原菌［15，16］、產鐵載體［17］、具有解磷能力［18-20］等。本試驗結果顯示，含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株處理對‘伊芙伯爵’株高都有顯著促進作用，這與舒健虹［12］、戚秀秀［21］等的研究結果類似。另一方面，含ACC脫氨酶的PGPR能夠降解ACC為α-酮丁酸和氨，使乙烯低于抑制植物生長的水平，最終達到促生長的效果，一般表現為根系數量的增加，進而促進其適應和生存［22，23］。本試驗中，菌株F195處理后的月季花朵乙烯釋放量顯著低于對照，在提高抗氧化酶活性方面也表現出了較其他菌株處理更好的效果，并顯著降低了MDA含量。這可能與菌株F195擁有最高的ACC脫氨酶活性相關。

光合作用貫穿于植物生長發育的各個階段并最終決定植物的生產量［24］。本研究中，與對照相比，菌株F195、F11和F23處理后的葉片蒸騰速率顯著提高，而水分轉運以及植物吸收地下營養物質依靠蒸騰作用，并且植物光合作用和氧化代謝中多余的熱能也是通過蒸騰作用散出。菌株F195也顯著提高了其氣孔導度，氣孔張開度的增加有利于大氣中的CO2進入，從而進一步促進光合作用的進行及植物的生長，這與內生細菌對芳樟光合特性的影響［25］結果相似。然而，菌株處理雖然都顯著增加了株高，但僅菌株F11處理的凈光合速率顯著高于對照，胞間CO2濃度、蒸騰速率也均顯著高于對照，這可能與其處理后的葉綠素含量較高有關；另外，F195菌株處理的氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率也均顯著高于對照，凈光合速率略低于對照，但差異不顯著，說明植物的凈光合速率不僅與葉片厚度、成熟度、光合色素含量等密切相關，還會受到外部環境因素如溫度和光照強度等的影響［26］。

葉綠素熒光參數能反映出植物光合作用的內在復雜過程［27-30］。秦嗣軍等［29］利用從野生東北山櫻根際分離到的3株PGPR菌株接種盆栽東北山櫻幼苗，發現接種臘質芽孢桿菌對葉綠素熒光參數無影響，而接種松鼠葡萄球菌后，幼苗的最大光化學效率增強。但Paradi等［30］在不同梯度磷養分條件下用叢枝菌根真菌聚生球囊霉接種長葉車前，得到叢枝菌根真菌對長葉車前最大光能轉換效率影響不顯著的結論。本研究結果也表明，接種含ACC脫氨酶的不同PGPR菌株也不能顯著提高切花月季的葉綠素熒光參數，有的菌株甚至會產生顯著的抑制作用。

綜合來看，接種植物促生菌可以使切花月季‘伊芙伯爵’株高增加，分枝增多，葉綠素含量增加，花朵乙烯釋放量減少，對其生長產生一定的促進作用。目前普遍認為，PGPR對植物生長的影響是間接的，通常是通過改善土壤理化特性來提高根系對水分和營養元素的吸收來促進植物生長和發育。這種間接作用可能才是接種PGPR菌株顯著提高切花月季株高的主要原因。此外，本試驗使用的菌株來自于不同的屬，如假單胞菌屬、寡養單胞菌屬、芽孢桿菌屬，均是植物根際促生菌的主要來源屬［31-33］。探索更多屬菌株的促生作用將有助于植物根際促生菌資源的豐富及開發利用。