熊果苷對乙酰膽堿-氯化鈣混合液誘導心房顫動大鼠心臟保護作用及其機制研究

徐銀麗，徐登月，于立明，趙繼凱，黃 濤，王輝山

北部戰區總醫院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016

心房顫動(atrial fibrillation，AF)為臨床上最常見的心律失常之一[1]。近年來，由于人口老齡化、慢性心臟病及其他因素影響，患病率呈上升趨勢，給患者家庭及社會造成沉重的經濟負擔。傳統的治療AF藥物如果使用不當，可導致患者藥物性心律失常。手術治療方式成本高、過程復雜、患者依從性差，并且術后存在復發風險。有研究表明，組織炎癥與AF的發生、發展存在密切聯系[2-3]，AF導致的血栓形成與白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等多種炎癥因子均相關[3]。目前，AF的發病機制仍不明確。因此，進一步明確AF病理生理機制，尋找更為安全有效的預防及治療手段至關重要。熊果苷(arbutin，AR)具有抗燙傷與抗氧化的特性[4]，通過抗氧化作用，能有效預防和保護腦細胞損傷[5]。同時，AR具有鎮咳、祛痰及平喘的藥理學作用，并能通過激活成骨細胞改善骨質疏松，下調大鼠C6膠質瘤細胞炎癥因子，進而誘導大鼠C6膠質瘤細胞凋亡[6-8]。本研究通過建立乙酰膽堿-氯化鈣混合液(acetylcholine chloride，Ach-CaCl2)誘導的大鼠AF模型，旨在探討AR對AF大鼠的心臟保護作用及可能機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選取30只8周齡健康雄性SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物有限公司)，體質量225～275 g。適應性喂養1周，均在環境溫度25℃下飼養，每12 h進行光照/黑暗條件交替，自由飲水攝食。待大鼠適應環境1周后，進行后續實驗。AR、Ach-CaCl2均購自中國阿拉丁試劑有限公司。酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA) 試劑盒購自中國江蘇酶免實業有限公司。IL-6、TNF-α、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K)抗體、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(phospho-protein kinase B，p-AKT)抗體、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phospho-mammalian target of rapamycin，p-mTOR)抗體、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)抗體、絲氨酸/蘇氨酸激酶(protein kinase B，AKT)抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體均購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 研究方法

1.2.1 模型構建及實驗分組 將30只健康雄性SD大鼠隨機分為3組：正常對照組(Sham組)、AF模型組(AF組)與AR治療組(AR+AF組)，每組各10只。3組大鼠適應性喂養7 d。AR+AF組大鼠預先100 mg/(kg·d)AR進行灌胃治療7 d。AF組和AR+AF組大鼠每天尾靜脈注射給予Ach-CaCl2混合液1 ml(內含Ach 66 μg/ml，CaCl210 mg/ml)，造模7 d[9]。Sham組大每天尾靜脈注射生理鹽水0.1 ml，共7 d。給藥結束后，取材進行后續實驗。

1.2.2 心電圖及超聲心動圖檢測各組大鼠心功能 使用2.0%異氟烷與氧氣(2 L/min)混合氣體吸入進行麻醉，1.5%異氟烷與氧氣(2 L/min)混合氣體維持，采用心電圖機對大鼠進行肢體導聯，采集心電圖。待心電圖記錄儀上各導聯平穩后，尾靜脈注射Ach-CaCl2混合液，給藥時間控制在30 s。開始給藥后，大鼠陸續被誘發了陣發性AF，待陣發性AF自行恢復至正常心律后停止記錄。記錄完最后1次心電圖后，剔除大鼠胸腹部毛發，涂上耦合劑，使用大鼠專用探頭，采用小動物彩色超聲進行超聲心動圖檢查。以二維超聲模式截取大鼠心臟的心動圖，測量大鼠的左心房內徑(left atrial diameter，LAD)評估左心房重構情況；以M型超聲測量左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVDD)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVDS)評估對大鼠左心室影響情況[10]。

1.2.3 心房組織Masson染色檢測心肌纖維化程度 取各組大鼠心房肌組織，經4%多聚甲醛固定、梯度脫水、浸蠟包埋、切片貼片、常規脫蠟后，行Masson染色。觀察各組大鼠心房肌組織膠原纖維的增生情況。

1.2.4 ELISA檢測各組大鼠血清炎癥因子 收集各組大鼠腹主動脈血1.2 ml，以3 000 r/min離心15 min，分離上層血清。測定大鼠血清TNF-α、IL-6水平。實驗過程嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。每個樣本設置3個復孔，取3個復孔的平均值。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測大鼠心房組織炎癥相關蛋白 取各組大鼠心房組織，分別稱量40 mg，加入200 μl蛋白裂解液，采用超聲破碎的方式提取組織蛋白。采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測心房組織p-PI3K、p-mTOR、p-AKT、TNF-α、IL-6、PI3K、AKT和mTOR等指標蛋白表達情況。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 9.0統計學軟件對數據進行處理。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠AF持續時間比較 Sham組大鼠為正常心電圖，竇性心律；AF組大鼠P波消失，代之以不規則的f波，心室率絕對不齊；AR+AF組大鼠為房撲心電圖。AF組大鼠AF持續時間顯著多于Sham組、AR+AF組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 AR對AF大鼠心臟電生理的影響(a.各組大鼠心電監測圖；b.各組大鼠AF持續時間統計圖)

2.2 各組大鼠LAD比較 各組大鼠超聲心動圖中，上半部分為二維超聲圖，下半部分為M型超聲圖。AF組大鼠LAD大于Sham組、AR+AF組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 AR對大鼠心房重構影響(a.各組大鼠超聲心動圖；b.各組大鼠LAD比較)

2.3 AR對大鼠組織形態的影響 各組大鼠心房組織Masson染色結果見圖3。Sham組心房肌組織正常，排列整齊，幾乎觀察不到間隙間膠原纖維；與Sham組相比，AF組心肌纖維紊亂，膠原纖維較多；與AF組相比，AR+AF組心肌排列稍有紊亂，僅存在少量膠原纖維。

圖3 各組大鼠心房組織 Masson 染色圖(Masson×400)

2.4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 與Sham組相比，AF組、AR+AF組的IL-6、TNF-α水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與AF組比較，AR+AF組的IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較(a.IL-6水平；b.TNF-α水平)

2.5 AR對AF大鼠心房組織炎癥相關蛋白的影響 與Sham組比較，AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達顯著增多，差異均有統計學意義(P<0.05)；與AF組比較，AR+AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。Western blot檢測結果見圖5。

圖5 AR對AF大鼠心房組織炎癥相關蛋白的影響(a.p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達量；b.TNF-a、IL-6蛋白表達量)

3 討論

AF為最常見的心律失常。有研究發現，在心臟組織和循環中介導炎癥反應的免疫細胞和蛋白質的浸潤與AF有關[3，7-8]。此外，心臟或體循環中存在的炎癥相關指標，可用于預測普通人群以及心臟電復律和射頻消融術后患者AF的發病及復發。炎癥反應介質可改變心房電生理和結構基質，從而導致AF的易感性增加。炎癥因子還可以調節鈣穩態和連接蛋白，與AF和異質性心房傳導的觸發相關[9-11]。血栓栓塞是AF的常見并發癥，其發生與炎癥活動有關。AR，化學式為C12H16O7，分子量272.25，是一種由杜鵑花科植物熊果葉中萃取出的成分。AR是酪氨酸酶的競爭性抑制劑，能夠通過抑制體內酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，并且對黑色素細胞毒性很小，是目前常用的褪色藥物[12]。同時，AR還有殺菌、消炎的作用，目前主要應用于化妝品中，同時也是腸道消炎用藥原料[13]。

本研究結果發現，AF組大鼠AF持續時間顯著多于Sham組、AR+AF組，差異均有統計學意義(P<0.05)。這說明，AR在大鼠陣發性AF模型中對大鼠心臟起到保護作用。小動物心臟超聲結果提示，AF組大鼠LAD大于Sham組、AR+AF組，差異均有統計學意義(P<0.05)。這說明，AR能明顯縮短AF大鼠LAD，改善AF大鼠左心房擴大的情況。另有研究表明，與正常竇性心律人群相比，單純性AF患者心房組織會出現膠原纖維的堆積[10]。本研究通過AF大鼠心房組織Masson 染色，可以看到AF組與AR+AF組比較，AF組膠原纖維較多，但心肌纖維化程度較低，可能與本研究造模時間短有關。有研究表明，AR具有可以增強自噬、抑制炎癥和凋亡的作用[12-15]。本研究結果還顯示，與Sham組比較，AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達顯著增多，差異均有統計學意義(P<0.05)；與AF組比較，AR+AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。這表明，AR對大鼠心臟的保護作用可能與其抑制炎癥作用有關。

綜上所述，AR可通過抑制PI3K-AKT、mTOR通路減輕炎癥，在大鼠陣發性AF模型中起到保護作用，具體分子機制仍需進一步深入研究。