加工工藝對醬牛肉蛋白質結構和水分分布的影響

李 素，王守偉，朱 寧，吳倩蓉，陳 松，臧明伍，趙 冰,3，張順亮，喬曉玲,*，潘曉倩，劉 夢，劉博文

（1.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068；2.河南雙匯投資發展股份有限公司，河南 漯河 462000；3.北京食品科學研究院，北京 100068）

醬牛肉是我國重要的傳統肉制品，此類產品具有風味獨特、高蛋白、低脂肪的特點，同時含有豐富的礦物質，營養價值較高。加工工藝的差異會影響醬牛肉的營養成分和質構特性等食用品質，而二次殺菌后產品品質劣變更為嚴重，比如生成高溫蒸煮味和組織質地變差等。為改善醬牛肉產品食用品質，探究其品質劣變機理，國內外學者開展了部分研究。陳立業等[1]發現定量鹵制工藝的醬牛肉食用品質優于常規煮制的醬牛肉；有學者發現超聲波輔助腌制可有效地提升醬牛肉的食用品質[2-3]。經查閱資料發現，針對醬牛肉產品風味成分分析的相關研究較多，Zou Yunhe等[4]研究了超聲輔助腌制對辣牛肉風味物質的影響；吳倩蓉等[5]研究了加工工藝對醬牛肉中蛋白質降解及風味物質的影響；Zang Mingwu[6]等對7種典型五香醬牛肉的揮發性風味進行了研究。高溫殺菌技術可以有效延長產品貨架期，不同的殺菌條件可以影響產品的風味、質構、營養等特性[7-9]，也會對蛋白質及產品結構造成較大程度的破壞。蛋白質是肉制品中主要的營養物質之一，肉品中蛋白質特性對肉制品的食用品質有重要影響[10-11]。為深入了解加工工藝對蛋白質影響機理，國內外學者開展了一些研究，其中，Sharedeh等[12]對滾揉腌制促進肉的鹽分滲透效果進行了評估；Deb-Choudhury等[13]分析了pH值、溫度和時間對食品中蛋白質品質特性的影響；康懷彬等[14]以牛背最長肌為研究對象，發現高溫加熱能顯著改變牛肉蛋白質的化學作用力及肌原纖維蛋白的結構。但是，經查閱資料發現，鮮有針對醬牛肉產品從蛋白質結構變化角度開展的加工工藝影響其品質的機理研究。此外，肌肉的微觀結構由肌纖維、水分、蛋白質等組成，肉制品水分分布情況也會影響蛋白質結構[15]和產品的食用品質[16]，因此，低場核磁共振弛豫測量法也被廣泛用于肌肉和肉中水分分布和流動性變化分析。

醬牛肉加工過程中會發生質量損失、蛋白變性、質構、風味變化等一系列物理化學變化[17-18]，部分變化會使得產品品質發生劣變。蛋白質是醬牛肉中的主要成分之一，深入分析加工過程中產品蛋白質結構變化，有助于明確醬牛肉品質形成機理，也可以為其他牛肉類高溫產品生產加工提供參考。鑒于鮮有針對傳統醬牛肉產品開展的從原料至最終產品水分分布和蛋白結構變化的研究，本研究以醬牛肉為研究對象，選取原料肉和滾揉腌制、鹵制及不同二次殺菌溫度（90、100、110、120 ℃）樣品，對其蛋白質濁度、相互作用力、結構變化和水分分布的規律進行研究，為醬牛肉產品品質精細化調控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛腱 河北福成五豐食品股份有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tris、KCl、尿素、NaOH、β-巰基乙醇國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

M2e多功能酶標儀 德國MD公司；Sorvall LYNX4000高速離心機、Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；LGJ-30D冷凍干燥機北京四環科學儀器廠有限公司；SU8020場發射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；NMI20-040-I核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照文獻[19]中方法進行醬牛肉加工，其中滾揉腌制用水量為牛肉質量的10%。依次對醬牛肉加工過程中原料肉、滾揉腌制樣品、鹵制樣品取樣，鹵制后產品采用4種溫度（90、100、110、120 ℃）殺菌20 min，殺菌完成后分別取樣。所選取7個取樣點的牛肉樣品（原料肉、滾揉腌制樣品、鹵制樣品、90 ℃殺菌樣品、100 ℃殺菌樣品、110 ℃殺菌樣品、120 ℃殺菌樣品）依次編號為A、B、C、D、E、F、G。

1.3.2 蛋白質提取

參考Visessanguan等[20]的方法并適當調整，取適量不同加工點的樣品絞碎，按1∶20（m/V）加入冷卻磷酸鹽緩沖液（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L NaH2PO4），10 000 r/min勻漿2 min，然后離心（4 ℃、8 000 r/min，7 min），收集上清液為肌漿蛋白溶液；沉淀部分繼續加入20 倍體積的冷卻提取液（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L NaH2PO4、0.7 mol/L NaCl），10 000 r/min勻漿2 min，4 ℃靜置過夜后離心，上清液為肌原纖維蛋白溶液。將制備的兩種蛋白溶液經冷凍干燥得到蛋白質凍干粉，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量測定試劑盒測定蛋白含量，以牛血清白蛋白作為標準物質繪制標準曲線，在562 nm波長處測定吸光度，取3次測定結果的平均值，蛋白質凍干粉密封后－20 ℃下貯藏備用。

1.3.3 濁度的測定

取各樣品蛋白質凍干粉，參照文獻[21]中方法測定濁度，平行測定3次，以350 nm波長處吸光度A350nm表示濁度。

1.3.4 相互作用力相對含量的測定

參考文獻[20]的方法并適當調整，結果取3次測定結果的平均值。

溶液配制：配制6 mol/L的KCl溶液為S1反應液；配制20 mmol/L Tris溶液調節pH值至8.0為S2反應液；配制pH 8.0、含1%（質量分數）的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的20 mmol/L Tris溶液，調節pH值至8.0即S3反應液；配制pH 8.0、含1%（質量分數）SDS和8 mol/L尿素的20 mmol/L Tris溶液，即S4反應液；配制pH 8.0、含1%（質量分數）SDS、8 mol/L尿素和2%（體積分數）β-巰基乙醇20 mmol/L Tris溶液，即S5反應液；0.5 mol/L NaOH為S6反應液。

樣品處理：取牛肉樣品各2.00 g，分別加入20 mL上述反應液于室溫下振搖4 h，其中加入S5反應液的樣品需先沸水浴2 min。樣品振搖結束后以6 000 r/min離心10 min，取上清液4 mL轉移至10 mL離心管中，加入體積分數50%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），使TCA終體積分數為10%，樣品于4 ℃下靜置18 h后離心（4 ℃、3 000 r/min，3 min），棄去上清液，向沉淀中分次加入0.5 mol/L NaOH，轉移至10 mL容量瓶定容，采用雙縮脲試劑法測定蛋白質量濃度，即不同反應液中蛋白質溶解度，以S1～S5反應液中蛋白質溶解度占S6反應液中蛋白質溶解度的百分比分別表征靜電相互作用力、范德華力、氫鍵、疏水相互作用力和二硫鍵相對含量。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察微觀結構

取各樣品蛋白質凍干粉粘貼于樣品銅臺，進行真空離子濺射噴金處理，電壓為3 kV，鍍膜2～3 min后進行掃描電子顯微鏡觀察，放大倍數為5 000 倍，電子顯微鏡圖比例尺為10 μm。

1.3.6 二級結構的測定

利用傅里葉變換紅外光譜儀測定蛋白質凍干粉的二級結構的變化。1 600～1 639 cm－1波段代表β-折疊結構；1 640～1 650 cm－1波段代表無規則卷曲結構（C=O與水形成氫鍵）；1 651～1 660 cm－1波段代表α-螺旋結構；1 661～1 700 cm－1波段代表β-轉角結構，根據峰面積計算各二級結構的相對含量。

1.3.7 水分分布的測定

將牛肉樣品切成長寬高約1 cm×1 cm×2 cm的肉塊，置于核磁共振成像儀永磁場中心位置的射頻線圈中心，進行磁共振波譜測定，共振頻率18 MHz，磁體強度0.5 T，線圈直徑為40 mm，磁體溫度為（32.00±0.01）℃。采用核磁共振分析軟件中的CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列測定樣品中的橫向弛豫時間T2，CPMG脈沖序列參數為：主頻23 MHz、偏移頻率286.781 3 kHz、90°脈沖時間17 μs，180°脈沖時間35 μs；采樣點數54 996；重復時間3 000 ms；累加次數4次；回波數2 000。結果取3次樣品測定的平均值。

1.4 數據處理與分析

利用Excel 2010軟件進行數據處理，采用Orign 8.0軟件進行繪圖，利用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著，利用Peakfit v4.12軟件分峰擬合，計算蛋白質二級結構相對含量。

2 結果與分析

2.1 蛋白質濁度變化

吸光度可以用來反映蛋白質聚集的程度，吸光度增加表示形成了大的聚合物。濁度可以反映蛋白質溶液中懸浮粒子的大小及數量，蛋白分散時懸浮顆粒直徑小，濁度低；蛋白聚集后，懸浮顆粒直徑變大，濁度也對應升高[22]。本研究用A350nm表征體系濁度。從圖1中可看出，醬牛肉加工過程中肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的濁度變化趨勢接近，原料肉質中蛋白質濁度較高，說明原料肉中蛋白質處于聚集狀態，懸浮顆粒直徑較大。滾揉工藝可以使蛋白質濁度顯著降低（P＜0.05），說明通過滾揉過程蛋白質結構被打散，溶解度增加，從而獲得較低的濁度。經熱加工后濁度增高，說明熱處理致使蛋白大量發生聚集、交聯、絮凝等變化，從而使蛋白溶液濁度上升。經過二次殺菌后蛋白質濁度呈波動變化趨勢，其中，90 ℃殺菌樣品與110 ℃殺菌樣品濁度較高，100 ℃殺菌樣品和120 ℃殺菌樣品濁度較低，隨殺菌溫度升高，樣品濁度變化無明顯規律，說明不同殺菌溫度條件下蛋白質內部基團暴露程度可能有所不同，主要相互作用力也不同，從而影響了蛋白聚集體的差異。馬海霞等[23]對烏賊肌原纖維蛋白不同加熱溫度下的濁度變化進行了研究，也發現隨著溫度升高濁度升高，但達到一定溫度后濁度開始有所降低。

圖1 醬牛肉樣品蛋白質濁度變化Fig. 1 Changes in turbidity of sarcoplasmic and myofibrillar protein from spiced beef

2.2 蛋白質相互作用力的變化

相互作用力可以影響蛋白質在不同溶劑中溶解度，醬牛肉加工過程中蛋白質分子間相互作用力會發生不同程度變化，進而影響其品質和加工性能。從圖2可以看出，樣品熟制前S1反應液中蛋白質溶解度較高，說明蛋白質間相互作用力主要是靜電相互作用力，且滾揉工藝顯著加強了蛋白質間的靜電相互作用力（P＜0.05），熟制后蛋白質溶解度顯著降低（P＜0.05），說明熱處理可以削弱蛋白質間的靜電相互作用力，不同溫度二次殺菌后樣品中蛋白質溶解度無顯著差異（P＞0.05）。S2反應液用于提取水溶性蛋白質，S2反應液中變化趨勢與S1反應液類似，即熟制前溶解度較高，熟制后溶解度降低，且滾揉工藝可以增加其溶解度；經煮制及殺菌等熱處理后溶解度降低，說明蛋白質多肽鏈發生伸展和去折疊，改變了蛋白質的天然結構，使其發生變性和聚集[24-25]，從而溶解度降低。原料肉中蛋白在S3反應液中溶解度最高，說明氫鍵是原料肉中主要相互作用力，且滾揉工藝顯著增加了蛋白質間氫鍵相互作用力（P＜0.05），經熟制后蛋白質在S3反應液中溶解度明顯降低，說明高溫使氫鍵發生了斷裂，致使其含量急劇減少，這與其他學者研究結果[14,26]一致，但本研究中不同殺菌溫度處理后氫鍵含量無顯著差異（P＞0.05）。S4反應液體系中的蛋白溶解度體現蛋白質間疏水相互作用力，原料肉中疏水作用力最低，經滾揉加工后疏水相互作用力增加，說明滾揉工藝可以促進疏水基團的暴露，促進疏水相互作用力提升，經鹵制工藝后疏水相互作用力大幅降低，可能是由于較高的加熱溫度使得疏水基團周圍的水分子有序度降低[27]；經二次殺菌的樣品，隨溫度升高，疏水相互作用力有緩慢降低的趨勢（P＞0.05），也可能是由于殺菌過程中壓力的增加使得蛋白質凝膠網狀結構逐步加強，蛋白質的三維結構被改變[28]。蛋白質在S5反應液中溶解度均處于較高水平，用于表示蛋白質間的二硫鍵，研究發現，原料肉中二硫鍵含量較低，經滾揉和熱處理后其含量顯著升高（P＜0.05），可能是蛋白質溶解度增高，蛋白質結構展開，暴露的巰基通過二硫鍵形成聚集，有研究表明熱處理可以促進蛋白質分子內二硫鍵的生成[29]。不同二次殺菌溫度對二硫鍵無顯著影響（P＞0.05）。

圖2 醬牛肉樣品中蛋白質分子間相互作用力變化Fig. 2 Changes of protein-protein interactions in spiced beef

2.3 蛋白質掃描電子顯微鏡觀察結果

醬牛肉加工過程中蛋白質會發生不同程度變性，致使蛋白質結構遭到破壞。加工過程中肌漿進行觀察蛋白及肌原纖維蛋白的微觀結構采用掃描電子顯微鏡進行觀察。在不同的加工步驟下，肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的結構有很大的不同，隨著加熱工藝的進行，蛋白質結構逐漸變得緊密，蛋白質之間的連接增強，孔洞數目增多，孔徑減小，微觀結構更加均勻細膩。

由圖3可知，原料樣品肌漿蛋白顆粒結構完整，表面比較平滑，聚集度較好，質地圓潤，飽滿且結構緊密。經滾揉工藝加工后肌漿蛋白結構發生變化，開始出現孔洞，蛋白質質地及光澤度也開始下降。經鹵制后蛋白質結構進一步遭到破壞。樣品經二次殺菌后其蛋白質結構被破壞程度更高，蛋白質顆粒破碎的更小、更細，此時，肌漿蛋白大部分變性，形成一種致密的結構，殺菌溫度越高，肌漿蛋白質變性程度越高。

圖3 醬牛肉樣品肌漿蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopic images of sarcoplasmic proteins in spiced beef

從圖4中可以看出，原料樣品肌原纖維蛋白結構比較完整，經滾揉工藝后肌原纖維蛋白開始斷裂，出現不規則孔洞。樣品經鹵制后蛋白的網狀結構開始變得粗糙，邊緣不規則，有明顯的斷層感。樣品經二次殺菌后蛋白結構再次發生變化，經90 ℃殺菌樣品中蛋白從各個方向進行交聯，網狀結構逐漸開始變得致密，隨著殺菌溫度逐漸升高，肌原纖維蛋白開始形成規則形狀，分布也逐漸變得均勻，無明顯孔洞，網絡結構變得更加致密均勻。

圖4 醬牛肉肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron microscopic images of myofibrillar proteins in spiced beef

2.4 蛋白質二級結構變化

醬牛肉加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的傅里葉變換紅外光譜如圖5所示。不同樣品的紅外吸收光譜呈現顯著差異。樣品在紅外區出現多個特征吸收峰，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在酰胺I帶（1 660 cm－1附近）、酰胺II帶（1 300 cm－1附近、1 570 cm－1附近）、酰胺A帶（3 300 cm－1附近）等處均有吸收峰出現。與原料肉相比，滾揉腌制工藝降低了肌漿蛋白中酰胺A帶的峰值，但增加了肌原纖維蛋白中酰胺A帶的峰值；鹵制工藝同時增加肌漿蛋白和肌原纖維蛋白酰胺A帶的峰值。隨著二次殺菌溫度的升高，肌漿蛋白酰胺A帶峰值呈現先增加后降低的趨勢，而肌原纖維蛋白酰胺A帶峰值呈現先降低后增加的趨勢，說明醬牛肉加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的氫鍵伸縮振動發生變化。1 900～1 200 cm－1波段不同樣品間吸光度差異較大，說明滾揉腌制、鹵制、二次殺菌工藝對蛋白質中雙鍵的伸縮振動影響不同，1 650 cm－1處吸收峰的差異主要是由C=O造成的，這可能與C=O結構的改變，包括羰基的氧化等有關。

蛋白質的二級結構反映了其主鏈原子的空間排布情況，不包括側鏈的構象變化。通常采用α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲這4種結構的變化表征蛋白質的二級結構變化[30]。紅外光譜圖酰胺I帶的峰主要是由羰基的伸縮振動造成的[31]，可直觀反映蛋白質構象變化，因此可以通過蛋白質二級結構所占比例分析蛋白質變性情況，從而確定醬牛肉加工工藝對蛋白質二級結構的影響。

圖5 醬牛肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of sarcoplasmic and myofibrillar proteins in spiced beef

由表1可知，原料肉中肌漿蛋白的無規卷曲相對含量最低，為7.85%。樣品經過滾揉腌制后，肌漿蛋白中α-螺旋、β-轉角相對含量顯著下降（P＜0.05），β-折疊、無規卷曲相對含量顯著增加（P＜0.05）；鹵制后其二級結構的相對含量與滾揉樣品相比無顯著變化（P＞0.05）；二次殺菌后樣品中肌漿蛋白的α-螺旋相對含量再次下降，無規卷曲相對含量整體上升，β-折疊、β-轉角相對含量也發生變化。以上變化說明滾揉工藝使蛋白質的有序結構被破壞，其結構穩定性降低，鹵制工藝未對其二級結構形成進一步的破壞作用，二次殺菌處理后，維持α-螺旋穩定的氫鍵繼續發生斷裂，隨殺菌溫度升高，α-螺旋、β-折疊總相對含量呈逐漸降低趨勢，說明肌漿蛋白結構的穩定性破壞程度逐漸增高，無序性增加。

表1 肌漿蛋白二級結構相對含量Table 1 Proportion of secondary structures in sarcoplasmic proteins

由表2可知，原料肉中肌原纖維蛋白的無規卷曲相對含量（8.98%）較低，樣品經過滾揉腌制后，各二級結構變化趨勢與肌漿蛋白中各二級結構變化趨勢一致，即α-螺旋、β-轉角相對含量顯著下降（P＜0.05），β-折疊和無規卷曲相對含量顯著增加（P＜0.05）；與滾揉樣品相比，鹵制后樣品中β-折疊、無規卷曲總相對含量顯著降低（P＜0.05）；二次殺菌樣品中隨著殺菌溫度的升高，各二級結構相對含量呈現波動變化趨勢，與肌漿蛋白中二級結構變化趨勢不一致，說明不同蛋白質可能具有不同的特征結構和作用位點，加工工藝的改變對不同蛋白質的影響可能存在差異。

表2 肌原纖維蛋白二級結構相對含量Table 2 Proportion of secondary structures in myofibrillar proteins

2.5 醬牛肉不同狀態水分分布

采用核磁共振對醬牛肉樣品中水分的變化進行檢測分析，采用CPMG序列和T2反演軟件得到醬牛肉的T2圖譜。表3是醬牛肉加工不同工藝點T2圖譜的具體數值，T21為結合水弛豫時間（0.1～10.0 ms），T22為束縛水弛豫時間（10～100 ms），T23為自由水弛豫時間（＞100 ms），分別將不同弛豫時間范圍內的峰面積（A）進行歸一化處理來表征不同狀態水分含量。T21代表與醬牛肉中大分子緊密結合的水，T22代表與醬牛肉中大分子結合比較緊密的水（束縛水），T23代表在醬牛肉中亞顯微結構之間的自由水。醬牛肉中A22在A總中的占比最大，說明水分主要以束縛水狀態存在。T2可反映不同狀態水分的流動性，T2越短，水的流動性越差，相同狀態水分的弛豫時間越長，說明水與肌肉結合狀態越松散[15]。由表3可知，原料肉經滾揉工藝后，樣品T22顯著增加（P＜0.05），T23無顯著變化（P＞0.05），但A23顯著增加（P＜0.05），說明滾揉工藝使肌肉中束縛水流動性增加，即滾揉增強了樣品的保水性，而自由水流動性不變，但自由水含量增加。鹵制后，樣品A21、A22顯著減小（P＜0.05），A23、T23顯著增加（P＜0.05），說明束縛水和結合水含量均減少，自由水含量和流動能力增加，可能是加熱使蛋白質空間構象發生變化，改變了束縛水和結合水與蛋白質的結合能力。不同二次殺菌溫度樣品間A21差異顯著（P＜0.05），100 ℃殺菌樣品中結合水含量最低；90、110、120 ℃二次殺菌處理組A22差異不顯著（P＞0.05），100 ℃殺菌樣品中束縛水含量最低，自由水含量最高；經二次殺菌后，醬牛肉樣品總峰面積差異不顯著（P＞0.05），100 ℃殺菌樣品中總水分含量最高。

表3 醬牛肉樣品水分分布狀態Table 3 Water distribution in spiced beef

3 結 論

醬牛肉加工過程中肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的濁度變化趨勢接近，原料肉中蛋白濁度最高，滾揉工藝可以將蛋白質結構打散，使濁度降低，經熱加工后濁度會逐漸增高。滾揉工藝可以提高加醬牛肉蛋白質間的相互作用力，提高其穩定性，熱處理前氫鍵、二硫鍵是主要作用力，熱處理后，穩定蛋白質的作用力主要是氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵，且二硫鍵在整個加工過程中均對蛋白質的穩定具有較高的貢獻度，不同二次殺菌溫度對氫鍵、疏水相互作用力、二硫鍵無顯著影響（P＞0.05）。從電子掃描顯微鏡結果可知，醬牛肉加工過程中滾揉、鹵制及殺菌工藝均會破壞蛋白質的結構，工藝過程增多，蛋白質結構被破壞越嚴重，二次殺菌溫度越高對其網狀結構破壞越嚴重。滾揉腌制、鹵制工藝可顯著影響醬牛肉樣品中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的二級結構，不同二次殺菌溫度處理后對各二級結構影響不同。醬牛肉樣品經滾揉工藝后束縛水流動性增加，自由水含量也增加；鹵制后束縛水和結合水含量減少，自由水含量和流動能力增加；隨著二次殺菌溫度的升高，總水分含量變化不顯著（P＞0.05）。