苯乳酸對(duì)具核梭桿菌的抑菌效果及機(jī)制

孔祥麗，馬巖石，吳昕雨，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）是革蘭氏陰性厭氧菌，擬桿菌科，梭桿菌屬，為人類共生菌。人類口腔、胃腸道等部位均發(fā)現(xiàn)其存在，該菌在不同的生態(tài)位下其種屬有一定的特異性，屬條件致病菌[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌與牙周疾病直接相關(guān)，其在口腔菌斑生物膜的形成中起到重要連接作用，且可協(xié)同其他口腔致病菌產(chǎn)生內(nèi)毒素及刺激因子，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[2-3]。Fn本身除了導(dǎo)致炎癥因子上調(diào)，誘發(fā)口腔癌[4]，亦是結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、乳腺癌等疾病的重要關(guān)聯(lián)菌[5-8]。Kashani等[9]對(duì)伊朗的80名Fn感染者分析發(fā)現(xiàn)，該菌可產(chǎn)生的特殊黏附素FadA，易形成生物膜。

苯乳酸作為天然有機(jī)酸，可以由部分乳酸菌通過苯丙酮酸在乳酸脫氫酶作用下產(chǎn)生[10]或由非乳酸菌如白地霉等產(chǎn)生[11]，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可耐受高溫等不良條件[12]，為天然、安全的抗菌劑[13]，能夠有效抑制細(xì)菌、真菌的生長，在抑制單增李斯特菌[14]、大腸桿菌[15]、陰溝腸桿菌[16]、糞腸球菌[16]、金黃色葡萄球菌[16]等方面均有報(bào)道。由此表明，該生物有機(jī)酸在抑菌方面具有良好的應(yīng)用潛力，但目前苯乳酸對(duì)Fn的抑菌作用及機(jī)制鮮有深入探究。

本課題組前期研究了200余種乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)Fn的抑菌性，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus rhamnosusGG、L. caseiM3和L. plantarumYYC-3的抑菌作用最好。此外，本團(tuán)隊(duì)前期研究還發(fā)現(xiàn)有關(guān)乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)防調(diào)控作用中，植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物對(duì)Fn導(dǎo)致的結(jié)直腸癌的預(yù)防作用最強(qiáng)[17]；研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌LY-78代謝產(chǎn)物中的多種有機(jī)酸有一定的抑菌作用，經(jīng)對(duì)比分析可知植物乳桿菌的抑菌性與其產(chǎn)生的天然有機(jī)酸苯乳酸相關(guān)[18]；此外，本課題組還研究了苯乳酸對(duì)陰溝腸桿菌、糞腸球菌生物膜的抑制能力，從破壞細(xì)胞膜角度出發(fā)，詳細(xì)探究了苯乳酸對(duì)這兩種菌的抑菌作用[19]。

鑒于Fn對(duì)于結(jié)腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞的保護(hù)及促生長和轉(zhuǎn)移的特性[20]，以及其可能于腸道形成生物膜對(duì)健康造成的威脅，本實(shí)驗(yàn)探究苯乳酸對(duì)Fn的生長抑制和破壞其形成生物膜的能力，在苯乳酸抑菌方面有重要的現(xiàn)實(shí)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

具核梭桿菌ATCC 25586 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；L-3-苯乳酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染液 美國Beckman Coulter公司；總蛋白（total protein，TP）測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所；75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇、95%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇、冰乙酸、0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）結(jié)晶紫染色液、甘油、4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚戊二醛、純叔丁醇北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀 芬蘭Growth Curves公司；JBQ-ZD全溫振蕩培養(yǎng)箱 常州普天儀器制造有限公司；LC-85C隔膜式抽氣泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；GI54DWS高壓滅菌器 美國致微儀器有限公司；3K 15高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；PB-10酸度計(jì) 北京賽多利斯科學(xué)儀器；SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀 上海美谷儀器有限公司、UV752N紫外分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限；Mini VIDAS全自動(dòng)熒光免疫分析儀 塞力斯醫(yī)療科技股份有限公司；Accuri C6 plus流式細(xì)胞儀 美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 Fn活化及培養(yǎng)

將200 μg Fn凍干菌粉接入10 mL液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，在37 ℃、氮?dú)?二氧化碳（9∶1，V/V）厭氧罐中厭氧培養(yǎng)4 d，使菌種恢復(fù)活力，將活化后的菌種以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至新鮮培養(yǎng)基，相同條件下厭氧培養(yǎng)，每隔48 h傳一代，傳代2次后將菌液離心（1 000×g、5 min），得到菌體沉淀，用新鮮培養(yǎng)基重懸并調(diào)整菌體濃度為1×106CFU/mL備用。

1.3.2 Fn生長曲線的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21]測(cè)定Fn生長曲線，在100 孔蜂窩板內(nèi)按照200 μL/孔添加1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL），設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，37 ℃、氮?dú)?二氧化碳（9∶1，V/V）條件下厭氧培養(yǎng)（后續(xù)厭氧條件同）48 h，利用Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀每隔30 min測(cè)定菌液在600 nm波長處的光密度值OD600nm，得到Fn生長曲線確定該培養(yǎng)條件下Fn的生長對(duì)數(shù)期。

1.3.3 苯乳酸最小抑菌質(zhì)量濃度及最小殺菌質(zhì)量濃度的測(cè)定

參照Kang Shimo等[22]的方法測(cè)定苯乳酸對(duì)Fn的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌質(zhì)量濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。在100 孔蜂窩板內(nèi)按照200 μL/孔添加1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL），按照22 μL/孔分別添加不同質(zhì)量濃度的苯乳酸溶液（終質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL），厭氧培養(yǎng)24 h，采用Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀每隔2 h測(cè)定1次OD600nm，記錄Fn的生長情況。在96 孔板內(nèi)按照100 μL/孔添加1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL），按照11 μL/孔分別添加不同質(zhì)量濃度的苯乳酸溶液（終質(zhì)量濃度為0、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0 mg/mL），厭氧培養(yǎng)0、24、48 h后用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600nm，并將48 h后測(cè)出OD600nm無明顯變化的菌液均勻涂到血平板中，厭氧培養(yǎng)72 h，根據(jù)菌落生長的情況來確定MIC和MBC。

1.3.4 苯乳酸的抑菌作用研究

1.3.4.1 菌體形態(tài)的觀察

先將無菌玻璃爬片（φ=8 mm）放入48 孔板中，按照250 μL/孔添加1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL），厭氧培養(yǎng)24 h后，每孔加入27.8 μL用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L、pH 7.2，下同）溶解的苯乳酸溶液，苯乳酸終質(zhì)量濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以等體積PBS做空白對(duì)照，處理2 h后吸棄溶液，添加預(yù)冷處理后的固定液，于4 ℃冰箱中放置8 h。吸棄孔板中的固定液，滴加PBS清洗，浸沒爬片后靜置10 min，重復(fù)3次。吸棄PBS后分別依次添加體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%的乙醇溶液靜置10 min，進(jìn)行脫水處理，然后吸棄乙醇溶液，添加無水乙醇脫水（靜置10 min）兩次，吸棄無水乙醇，添加無水乙醇-純叔丁醇（1∶1，V/V）溶液靜置15 min，吸棄溶液加入叔丁醇靜置15 min，吸棄叔丁醇后再次加入叔丁醇靜置15 min，吸棄叔丁醇后進(jìn)行凍干、噴金處理[23]，然后將玻璃片放置于掃描電子顯微鏡載物臺(tái)進(jìn)行觀察。

1.3.4.2 Fn上清液蛋白含量和pH值的測(cè)定

將1 mL 1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL）離心（1 000×g、3 min）后得到菌體。用1 mL PBS重懸菌體后離心（1 000×g、3 min）棄去上清液，此步驟進(jìn)行兩次，添加1 mL質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mg/mL的苯乳酸溶液，以等體積無菌水做空白對(duì)照，厭氧培養(yǎng)2 h后，1 000×g離心5 min，取0.5 mL上清液根據(jù)TP測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定蛋白含量，結(jié)果以樣品在595 nm處的光密度值OD595nm表示。另外，取5 mL相同處理方法得到的上清液，用PB-10酸度計(jì)在20 ℃下測(cè)定氧化還原電位（oxidation-reduction potential，ORP）和pH值。

1.3.4.3 Fn細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

取1 mL 1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL）離心（1 000×g、3 min），加入1 mL PBS重懸再次離心（1 000×g、3 min），棄去上清液，分別添加1 mL不同質(zhì)量濃度（1/2 MIC、MIC）的苯乳酸溶液，以等體積無菌水為空白對(duì)照，以等體積十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTMAB）（能溶解革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜）作為熒光染色的陽性對(duì)照[24]，厭氧培養(yǎng)2 h。分別添加10 μL 1 mg/mL的PI染液，在4 ℃下染色20 min后，1 000×g離心5 min，添加1 mL PBS重懸后離心（1 000×g、5 min），棄去上清液，用200 μL PBS重懸菌體后在全自動(dòng)熒光免疫分析儀觀察和流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度，通過Accuri C6 plus流式細(xì)胞儀計(jì)算Fn熒光陽性百分率。

1.3.4.4 Fn胞內(nèi)蛋白的電泳分析

取1 mL 1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL），分別添加111 μL不同質(zhì)量濃度的苯乳酸溶液（終質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.8 mg/mL），以等體積無菌水作為空白對(duì)照，厭氧培養(yǎng)處理2 h后離心（3 000×g、5 min）得到菌體沉淀。按照10 mL/g添加細(xì)菌裂解液（含1%（體積分?jǐn)?shù)）蛋白酶抑制劑的溶菌酶（20 kU/mL）），研磨并反復(fù)凍融3次，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，采用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）濃縮膠和10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分離膠，加樣量為20 μL，開始電壓為80 V，30 min后調(diào)整電壓為120 V直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)染色分析Fn菌體胞內(nèi)蛋白組成的變化。

1.3.4.5 Fn生物膜含量的測(cè)定

參考1.3.4.1節(jié)方法觀察厭氧培養(yǎng)48 h的空白對(duì)照組和MIC苯乳酸（0.1 mol/L、pH 7.2 PBS溶解）處理2 h后Fn的生物膜。采用結(jié)晶紫染色法評(píng)估Fn的生物膜形成能力。取1.3.1節(jié)活化后的菌液（1×106CFU/mL），按照200 μL/孔添加至96 孔板，厭氧培養(yǎng)48 h后分別添加22 μL/孔苯乳酸、乳酸溶液（終質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL），以等體積無菌水作為空白對(duì)照，厭氧培養(yǎng)處理2 h。吸出培養(yǎng)液用于測(cè)定pH值；孔內(nèi)菌體用無菌PBS洗滌3次，除去松散附著的細(xì)胞，室溫下干燥。每孔中添加100 μL 95%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇固定15 min后，棄去液體并風(fēng)干。每孔加入100 μL 0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）結(jié)晶紫染色10 min。無菌PBS沖洗3次，風(fēng)干。添加100 μL/孔的體積分?jǐn)?shù)33%醋酸溶液溶解10 min，在450 nm波長處測(cè)定光密度值OD450nm，以表征生物膜含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 26.0軟件中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2018 9.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fn生長穩(wěn)定期的確定

采用Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀測(cè)定Fn在48 h內(nèi)OD600nm變化，得到細(xì)菌的生長曲線，并確定Fn的對(duì)數(shù)生長期。如圖1所示，經(jīng)培養(yǎng)6 h后，F(xiàn)n可達(dá)到生長對(duì)數(shù)期，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為27 h，菌株達(dá)到生長穩(wěn)定期，因此Fn的最佳生長周期為27 h。在27 h前后選取一個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)研究的統(tǒng)一判定時(shí)間，即選取24 h和48 h作為判斷苯乳酸抑菌效果的時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定苯乳酸對(duì)Fn生長的影響。

圖1 Fn的生長曲線Fig. 1 Fn growth curve

2.2 苯乳酸對(duì)Fn的抑制效果

在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的苯乳酸溶液，確定Fn不再生長甚至死亡時(shí)苯乳酸的最小質(zhì)量濃度。如圖2A所示，隨苯乳酸質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)n的生長速率減慢。在24 h厭氧培養(yǎng)期間，0.4 mg/mL苯乳酸即導(dǎo)致Fn的生長速率明顯降低，0.7 mg/mL苯乳酸對(duì)Fn達(dá)到完全抑制，且0.7 mg/mL苯乳酸處理2 h就產(chǎn)生了抑制效果。如圖2B所示，0.4 mg/mL苯乳酸處理0 h和24 h的OD600nm差異較小，苯乳酸質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL即可在短時(shí)間內(nèi)完全抑制Fn生長。加入0.5 mg/mL苯乳酸厭氧培養(yǎng)24 h和48 h后OD600nm差異不明顯。因此，苯乳酸對(duì)Fn的MIC為0.5 mg/mL。將質(zhì)量濃度0.5 mg/mL苯乳酸處理48 h后的Fn菌液涂在血平板上，厭氧培養(yǎng)72 h時(shí)的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為3.5×103CFU/mL，而質(zhì)量濃度大于或等于0.7 mg/mL的苯乳酸處理組無活菌檢出，此結(jié)果與圖2A結(jié)果一致。因此，苯乳酸對(duì)Fn的MBC為0.7 mg/mL。

圖2 苯乳酸對(duì)Fn生長的影響Fig. 2 Effect of phenyllactic acid on Fn growth

2.3 苯乳酸對(duì)Fn形態(tài)的影響

Thakur等在納米粒子對(duì)細(xì)菌作用的研究中采用掃描電子顯微鏡觀察到菌體損傷[25]，孫明明等[26]也采用此技術(shù)觀察菌體損傷。因此，為闡明苯乳酸對(duì)Fn抑制機(jī)制，本研究通過掃描電子顯微鏡成像技術(shù)觀察菌體形態(tài)變化。

從圖3A可看出，空白對(duì)照組的Fn兩端為梭狀，表面光滑。加入1/2 MIC苯乳酸處理后，F(xiàn)n表面有少量蛋白溶出現(xiàn)象，部分菌體抱團(tuán)、黏連，菌體表面變得粗糙和部分溶解，表面變得不光滑（圖3B）。經(jīng)MIC苯乳酸處理后，F(xiàn)n細(xì)胞壁可能受損，細(xì)菌形態(tài)變得纖細(xì)，且表面產(chǎn)生大量凸起（圖3C），推測(cè)為胞內(nèi)物質(zhì)滲出。經(jīng)2 MIC苯乳酸處理后，F(xiàn)n已無法維持正常菌體形態(tài)，表面粗糙不平，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁嚴(yán)重?fù)p壞（圖3D）。由此可推測(cè)苯乳酸破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏。

圖3 苯乳酸對(duì)Fn菌體形態(tài)的影響Fig. 3 Effect of phenyllactic acid on the morphology of Fn

2.4 苯乳酸處理對(duì)Fn上清液中蛋白含量、氧化還原電位和pH值的影響

苯乳酸處理后的Fn菌體上清液中蛋白含量（OD595nm）發(fā)生變化，推斷為細(xì)胞膜透過性受損、細(xì)菌內(nèi)容物溶出[27]，可通過OD595nm反映細(xì)胞膜的破壞程度。由圖2可知，苯乳酸質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL可明顯影響Fn的生長，為探究不同質(zhì)量濃度苯乳酸對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響，采用0.2、0.4、0.8、1.6、2.4 mg/mL的苯乳酸處理Fn，測(cè)定細(xì)菌上清液中蛋白含量、ORP、pH值。

由圖4A可知，與空白對(duì)照組相比，0.2、0.4 mg/mL苯乳酸處理組上清液中蛋白含量均顯著增加（P＜0.05）。而在更高質(zhì)量濃度的苯乳酸作用下，與0.4 mg/mL組相比，上清液中蛋白含量顯著減少（P＜0.05），其原因可能是隨苯乳酸質(zhì)量濃度增加，溶液酸度升高，0.4 mg/mL苯乳酸處理組pH值為5.43±0.01，0.8 mg/mL苯乳酸處理組pH值則為4.50±0.01（圖4B），已低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，由于酸的作用，上清液中的蛋白質(zhì)發(fā)生沉降而含量降低。隨著苯乳酸的質(zhì)量濃度增加，上清液的ORP總體呈增加趨勢(shì)，即氧化性增強(qiáng)，培養(yǎng)基中雜質(zhì)減少，進(jìn)一步證明上清液蛋白質(zhì)發(fā)生了沉降。苯乳酸質(zhì)量濃度低于MIC時(shí)（0～0.4 mg/mL苯乳酸），苯乳酸處理質(zhì)量濃度與上清液蛋白含量呈正相關(guān)，表明苯乳酸對(duì)Fn的抑制機(jī)制可能分為兩方面，一是刺激Fn產(chǎn)生更多胞外分泌蛋白；二是破壞其細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物外泄。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析苯乳酸對(duì)Fn細(xì)胞膜完整性的影響。

圖4 苯乳酸處理Fn后上清液中蛋白含量、ORP、pH值的變化Fig. 4 Changes in protein content, oxidation-reduction potential, and pH in Fn culture supernatant after treatment with phenyllactic acid

2.5 苯乳酸對(duì)Fn細(xì)胞膜完整性的影響

熒光標(biāo)記法是通過熒光探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合產(chǎn)生特殊的熒光，熒光的數(shù)量和強(qiáng)度可反映被測(cè)物的含量，流式細(xì)胞儀能定量分析該熒光強(qiáng)度，黃云坡等[28]通過這兩種方法綜合評(píng)價(jià)苯乳酸對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞膜的破壞程度，張宇婷等[29]采用該方法檢測(cè)活菌數(shù)，本實(shí)驗(yàn)采用同樣方法檢測(cè)苯乳酸對(duì)Fn細(xì)胞膜的通透性及完整性的影響。

PI是一種不能通過完整細(xì)胞膜的DNA熒光探針，當(dāng)細(xì)胞膜受損后PI可進(jìn)入細(xì)胞并與DNA結(jié)合，在546 nm波長處發(fā)出紅色熒光?？瞻讓?duì)照組的Fn中有少量凋亡，經(jīng)PI熒光探針染色后，僅出現(xiàn)少許紅色熒光（圖5A），1/2 MIC苯乳酸處理Fn 2 h后，紅色熒光強(qiáng)度有所增加（圖5B），即細(xì)胞的通透性增加；MIC苯乳酸處理Fn時(shí)，細(xì)胞膜損傷程度進(jìn)一步增加，紅色熒光強(qiáng)度明顯增多，在整個(gè)檢測(cè)范圍內(nèi)產(chǎn)生均勻的光斑（圖5C）。同時(shí)，將經(jīng)過CTMAB處理細(xì)胞膜的熒光狀態(tài)作為陽性對(duì)照組（圖5D），與陽性對(duì)照組相比，1/2 MIC苯乳酸處理的Fn細(xì)胞膜受損程度較小，而MIC苯乳酸處理的細(xì)胞膜損傷程度與之接近。

圖5 熒光探針法檢測(cè)苯乳酸對(duì)Fn細(xì)胞膜的破壞作用Fig. 5 Destructive effect of phenyllactic acid on the cell membrane of Fn demonstrated by fluorescent probe method

利用流式細(xì)胞儀來檢驗(yàn)苯乳酸處理后的效果。如圖6所示，空白對(duì)照組的Fn熒光陽性率為3.6%（圖6A），為細(xì)菌正常代謝凋亡比例，1/2 MIC苯乳酸處理后細(xì)胞的熒光陽性率達(dá)到10.9%（圖6B），MIC苯乳酸處理后的Fn的熒光陽性率達(dá)到51.6%（圖6C），而陽性對(duì)照組的熒光陽性率為45.9%（圖6D），該結(jié)果與全自動(dòng)熒光免疫分析儀結(jié)果（圖5）一致。綜上所述，苯乳酸破壞了Fn細(xì)胞膜的選擇透過性及完整性，細(xì)胞膜通透性提高。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)苯乳酸對(duì)Fn細(xì)胞膜的影響Fig. 6 Effect of phenyllactic acid on Fn cell membrane determined by flow cytometry

2.6 苯乳酸對(duì)Fn胞內(nèi)蛋白的影響

細(xì)胞膜不僅可選擇性使大分子進(jìn)入，也可控制胞內(nèi)物質(zhì)流出，檢測(cè)Fn胞內(nèi)蛋白的含量可反映Fn細(xì)胞膜控制物質(zhì)流出的能力?？赏ㄟ^SDS-PAGE檢測(cè)胞內(nèi)蛋白分子質(zhì)量及含量的變化[30]，從而反映苯乳酸對(duì)Fn胞內(nèi)蛋白的影響。

圖7 Fn胞內(nèi)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 7 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis patterns of intracellular proteins from Fn

如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過0.2、0.4 mg/mL的苯乳酸處理后Fn中分子質(zhì)量為130 kDa以上的蛋白數(shù)量減少，70 kDa左右蛋白含量增多，說明苯乳酸影響了Fn的代謝過程，改變了蛋白合成途徑。0.8 mg/mL的苯乳酸使其胞內(nèi)蛋白含量減少，這與之前發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)外泄結(jié)果相一致，由于細(xì)胞膜破損嚴(yán)重，相對(duì)較大的蛋白分子也流出，導(dǎo)致細(xì)菌活性減弱，合成蛋白能力降低，蛋白含量減少。這與寧亞維等[31]探究苯乳酸對(duì)假單胞菌細(xì)胞膜影響的結(jié)果一致。由此證明苯乳酸可破壞Fn細(xì)胞膜的完整性。

2.7 苯乳酸對(duì)Fn形成生物膜的影響

以往的研究結(jié)果表明，F(xiàn)n可產(chǎn)生大量黏多糖等物質(zhì)，幫助菌體在細(xì)胞表面形成保護(hù)層[32]，被歸類為生物膜。生物膜通常為胞外多聚物，目前生物膜的測(cè)定公認(rèn)為結(jié)晶紫法[33]，該檢測(cè)法價(jià)格低廉、簡便且結(jié)果準(zhǔn)確性高，可直接顯示生物膜的變化[34]。本研究在由Fn形成的生物膜上加入苯乳酸，探究其對(duì)生物膜的作用。并通過掃描電子顯微鏡觀察該膜的致密程度和菌體數(shù)量變化。

如圖8A所示，經(jīng)過48 h培養(yǎng)，空白對(duì)照組中大量Fn形成致密的生物膜，黏附在培養(yǎng)玻璃片（φ=8 mm）表面，F(xiàn)n尖端相連，并有所纏繞，PBS清洗不易脫落；但經(jīng)MIC苯乳酸處理2 h后，視野內(nèi)Fn數(shù)量明顯減少，且生物膜暴露出不規(guī)則孔洞，致密程度下降，菌體連接較松散，由空白對(duì)照中的纏繞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫w之間的黏連（圖8B），其胞外物質(zhì)表觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不規(guī)則空隙，表明苯乳酸破壞了該生物膜結(jié)構(gòu)。由此可知，苯乳酸能抑制Fn的生長，進(jìn)而抑制生物膜的形成，并且能使原有的生物膜脫落和破損，說明苯乳酸對(duì)Fn形成的生物膜有良好的消殺作用。

圖8 苯乳酸處理對(duì)Fn生物膜形態(tài)的影響Fig. 8 Morphology of biofilm produced by Fn

苯乳酸作為有機(jī)酸的一種，使溶液呈酸性，前期研究結(jié)果顯示其酸性會(huì)使蛋白沉降（體系pH值低于等電點(diǎn)），因此，測(cè)定相同條件和質(zhì)量濃度乳酸、苯乳酸處理體系的pH值和形成生物膜含量（OD450nm），并進(jìn)行對(duì)比分析。

表1 苯乳酸和乳酸對(duì)Fn形成生物膜的影響Table 1 Effect of phenyllactic acid on biofilm formation of Fn

如表1所示，與空白對(duì)照組相比，0.5 mg/mL苯乳酸處理組的生物膜含量顯著降低（P＜0.05）。相同質(zhì)量濃度苯乳酸和乳酸處理對(duì)Fn生物膜的破壞性差異明顯，0.5 mg/mL乳酸處理組的生物膜含量與空白對(duì)照組相比無顯著差異（P＞0.05）。0.5 mg/mL乳酸組的pH值遠(yuǎn)低于0.5 mg/mL苯乳酸組，說明苯乳酸對(duì)生物膜的破壞性來自于其本身的結(jié)構(gòu)，而非由其酸性導(dǎo)致的。

3 結(jié) 論

苯乳酸對(duì)Fn具有良好的抑菌能力，其抑菌機(jī)制為改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)蛋白外泄；且苯乳酸降低了Fn的黏附性，對(duì)其生物膜亦具有破壞作用。因此，未來可將苯乳酸應(yīng)用于調(diào)控腸道微生態(tài)及預(yù)防腸道病原菌生物膜引發(fā)疾病的功能性食品。