二甲雙胍通過己糖激酶2調節糖酵解途徑抑制卵巢癌細胞增殖和遷移

林莉香 云紅葉 黃守國 (中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院婦產科，海南 海口 570208)

卵巢癌是最致命的女性婦科腫瘤之一，因卵巢癌早期癥狀不明顯，多數患者發現時已處于中晚期，導致死亡率較高〔1〕。目前臨床上治療卵巢癌的手段主要為外科手術和全身化療，但仍具有較高的復發率〔2〕。二甲雙胍是治療糖尿病的一種有效藥物，越來越多的研究已經證實二甲雙胍在治療婦科相關腫瘤中同樣具有顯著的療效〔3～5〕，例如研究〔6〕發現二甲雙胍可通過介導信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT)3信號通路抑制卵巢癌細胞的惡性生物學行為，進而發揮抗癌作用，然而二甲雙胍在卵巢癌中的作用機制尚未完全明確。有研究發現己糖激酶(HK)2在卵巢癌組織中高表達，且高表達的HK2可顯著促進卵巢癌細胞增殖〔7〕，本研究旨在探討二甲雙胍對卵巢癌細胞增殖、遷移及糖酵解的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 SKOV3細胞購自碧云天生物技術有限公司。二甲雙胍粉末(純度：≥98%，貨號：D9351)購自北京索萊寶有限公司；Lipofectamine 2000、DMEM、青霉素、鏈霉素購自北京杰輝博高生物技術有限公司；CCK-8試劑購自愛必信(上海)生物科技有限公司；HK2抗體(HK8797)購自上海戶實科技有限公司；E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)抗體(ab40772)、鋅指轉錄因子(Snail)抗體(ab216347)、β-actin抗體(ab115777)購自Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(AS003)購自蘇州遠東普惠生物技術有限公司；葡萄糖攝取比色檢測試劑盒(MAK083-1KT)、乳酸比色測定試劑盒(MAK058-1KT)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；ATP比色試劑盒(BJ-S6336)購自上海邦景實業有限公司；pcDNA-NC和pcDNA-HK2由上海吉瑪生物技術有限公司提供。

1.2細胞培養〔8〕參考文獻〔4〕的方法復蘇細胞，觀察細胞，當細胞密度達到90%時進行傳代：用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次后去除血清，用500 μl的胰酶(含DMEM)進行消化，37℃，5% CO2培養箱靜置4 min后加入1 ml DMEM完全培養基終止消化，離心后(1 000 r/min，5 min)棄上清，加入1 ml DMEM重懸細胞，于條件為37℃，5%CO2培養箱中進行培養。

1.3細胞轉染與分組〔9〕當細胞融合度≥80%時，收集細胞，用不同濃度的二甲雙胍(0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L)處理細胞，記為0、5、10、20 mmol/L Met組，進行增殖遷移等系列實驗，選用作用效果最好的二甲雙胍劑量組進行后續研究。二甲雙胍的配制參考文獻〔4〕，并將細胞分為Met+pcDNA-NC組(最佳劑量二甲雙胍+轉染pcDNA-NC)，Met+pcDNA-HK2組(最佳劑量二甲雙胍+轉染pcDNA-HK2)，待細胞融合度≥80%時，根據Lipofectamine2000操作說明分別把pcDNA-NC和pcDNA-HK2轉染至SKOV3細胞，培養48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.4CCK-8實驗檢測SKOV3細胞增殖〔10〕收集各組細胞，將細胞接種于96孔板上，密度為6 000個/孔，培養箱培養24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續培養2～3 h，之后用酶標儀于450 nm處測定吸光值，之后的每天同一時間點加入CCK-8試劑，培養2～3 h后檢測吸光值，共檢測4 d。

1.5SKOV3細胞葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP含量的測定〔11〕參考文獻〔4〕的方法，將細胞接種于96孔板中，用100 ml KRPH緩沖液(含2%牛血清白蛋白)孵育細胞40 min 后加入10 ml L2-DG，20 min后根據葡萄糖攝取試劑盒說明進行測定。乳酸和ATP含量的測定嚴格按照乳酸測定試劑盒和ATP比色試劑盒操作說明書進行操作。

1.6Transwell檢測SKOV3細胞遷移能力〔12〕收集各組細胞，用無血清培養基處理細胞，Transwell小室膜水化預處理后，上室加入100 μl的細胞懸液，下室加入完全培養基，培養箱培養24 h后，進行固定和染色，隨機選取視野顯微鏡下進行觀察，并記錄。

1.7Western印跡檢測SKOV3細胞中HK-2、E-cadherin和Snail蛋白的表達〔13〕收集各組細胞，用PBS洗滌，加入放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，裂解30 min后離心，收集上清，利用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白，進行定量，根據定量的結果進行電泳并轉膜，并用5%的脫脂牛奶進行封閉1 h，然后加入HK2(1∶500)、E-cadherin(1∶10 000)、Snail(1∶1 000)、β-actin(1∶200)一抗，4℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，共孵育1 h后，加入電化學(ECL)發光液進行曝光。

1.8統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1二甲雙胍對卵巢癌細胞增殖的影響 不同濃度的二甲雙胍處理卵巢癌SKOV3細胞72 h后，卵巢癌細胞的增殖均受到顯著抑制(P<0.05)，其中20 mmol/L二甲雙胍組對細胞增殖的抑制效果最明顯。見表1。

表1 各組不同時間點OD值比較

2.2二甲雙胍對卵巢癌細胞遷移的影響 與0 mmol/L Met組相比，其他組SKOV3細胞遷移數目、Snail蛋白表達量顯著減少(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，20 mmol/L Met組效果最明顯(P<0.05)，見圖1，表2。

1～4:0 mmol/L Met組，5 mmol/L Met組，10 mmol/L Met組，20 mmol/L Met組；圖2同圖1 二甲雙胍對卵巢癌細胞E-cadherin和Snail蛋白表達的影響

表2 各組遷移數目、E-cadherin、Snail蛋白表達水平、葡萄糖攝取、乳酸產生、ATP濃度比較

2.3二甲雙胍對卵巢癌糖酵解的影響 由表2可見，不同濃度的二甲雙胍處理細胞后，與0 mmol/L Met組相比，其他組葡萄糖攝取、乳酸產生及ATP濃度均顯著下降(P<0.05)，但5 mmol/L Met組的葡萄糖攝取除外(P>0.05)，20 mmol/L Met組效果最明顯(P<0.05)。

2.4二甲雙胍對HK2表達的影響 與0 mmol/L Met組HK2蛋白水平(0.94±0.09)相比，5、10、20 mmol/L Met組〔(0.72±0.07)、(0.62±0.08)、(0.41±0.06)〕均顯著降低(P<0.05)，20 mmol/L Met組效果最明顯(P<0.05)，見圖2。

圖2 二甲雙胍對卵巢癌細胞HK2蛋白表達的影響

2.5二甲雙胍通過HK2抑制卵巢癌細胞增殖 與Met+pcDNA-NC組相比，Met+pcD-NA-HK2組48 h后細胞增殖和HK2蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)，見圖3、表3。

1，2：Met+pcDNA-NC組，Met+pcDNA-HK2組；下圖同圖3 各組卵巢癌細胞HK2蛋白表達的比較

表3 各組細胞HK2蛋白表達水平以及OD值的比較

2.6二甲雙胍通過HK2抑制卵巢癌糖酵解途徑與Met+pcDNA-NC組相比，Met+pcDNA-HK2組葡萄糖攝取、乳酸產生及ATP濃度顯著增加(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞葡萄糖攝取、乳酸產生和ATP濃度、遷移數目、E-cadherin、Snail蛋白水平的比較

2.7二甲雙胍通過HK2抑制卵巢癌細胞遷移 與Met+pcDNA-NC組相比，Met+pcDNA-HK2組的細胞遷移數目和Snail蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表達量顯著減少(P<0.05)。見表4、圖4。

圖4 各組細胞E-cadherin和Snail蛋白表達的比較

3 討 論

鉑類化療是臨床上治療卵巢癌的主要手段之一，但化療的失敗是導致卵巢癌復發的主要原因〔14〕。研究發現二甲雙胍抗腫瘤有顯著療效，曹妮妮等〔15〕發現二甲雙胍可顯著抑制肺癌細胞的增殖和遷移。研究發現二甲雙胍可抑制卵巢癌細胞的增殖及遷移能力〔4〕，鄒歌等〔16〕研究已證實二甲雙胍可抑制卵巢癌細胞的遷移。

腫瘤細胞即使在有氧環境下仍然進行無氧糖酵解，這種現象的發生可以增加代謝通量向多個生物途徑轉移，產生的能量可促進腫瘤細胞的增殖〔17〕。目前已有研究證實糖酵解途徑參與卵巢癌的發生和發展〔18〕。本研究結果提示二甲雙胍可通過調控糖酵解途徑抑制SKOV3細胞的增殖和遷移。在正常情況下，HK2位于細胞質和線粒體上，HK2的主要作用就是參與糖酵解，為細胞提供能量。線粒體中產生的ATP會通過線粒體通透性轉換孔(mPTP)釋放到細胞質中，然后構成mPTP的HK2和電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白(VDAC)1的結合會得到附近的能量供應，從而促進糖酵解的發生〔19〕。本研究結果發現HK2可扭轉二甲雙胍對SKOV3細胞增殖、糖酵解及細胞遷移的抑制。

綜上，二甲雙胍可通過下調HK2的表達抑制SKOV3細胞糖酵解，進而抑制SKOV3細胞的增殖和遷移。