結腸癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表達水平及臨床意義

陳文霞 劉艷紅 肖興國 張磊 王琳 吳慧麗

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院消化內科，河南 鄭州 450007)

微小RNA(miRNA)是一類非編碼單鏈RNA分子，并可通過與靶基因信使RNA(mRNA)相結合從而調控細胞增殖、分化等過程，研究顯示miRNA在結腸癌中異常表達并可能參與結腸癌發生及發展過程〔1～4〕。miR-17-5p在口腔鱗狀細胞癌中呈高表達并可作為評估患者術后復發的重要指標〔5〕。miR-25-3p在三陰性乳腺癌中呈高表達，并可作為臨床診斷的重要指標〔6〕。但miR-17-5p、miR-25-3p在結腸癌中的表達及其作用機制尚未完全闡明。本研究探討miR-17-5p、miR-25-3p在結腸癌患者血清中的表達水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年2月至2017年8月鄭州大學附屬鄭州中心醫院收治的92例結腸癌患者為研究對象，年齡50～75歲，平均(62.13±12.15)歲，男49例，女43例，患者均經病理證實為結腸癌。根據miR-17-5p、miR-25-3p表達量的平均值將結腸癌患者分為miR-17-5p高表達組(62例)、miR-17-5p低表達組(30例)、miR-25-3p高表達組(58例)、miR-25-3p低表達組(34例)。 排除標準：合并其他惡性腫瘤；肝、腎等重要器官嚴重受損。選取同期醫院健康體檢的志愿者92例為對照組，其中男50例，女42例，年齡48～72歲，平均(61.28±10.54)歲。兩組受試者年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。抽取兩組受試者靜脈血5 ml，4℃條件下經12 000 r/min離心10 min，分離血清置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2主要試劑 miR-17-5p、miR-25-3p引物由上海生工生物工程股份有限公司；Trizol試劑購自北京全式金生物技術有限公司提供；反轉錄與實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-17-5p、miR-25-3p的表達水平 采用Trizol法提取血清中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。參照反轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA。引物序列為：miR-17-5p正向5′-TGGTGACCAGCTGATCGTAC-3′，反向5′-TCGCATCGACTAGCTACTACG-3′；miR-25-3p正向5′-TTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′，反向5′-TGACTGACTGACGTGACTCC-3′；U6正向5′-ATTGGAACG ATACAGAGAAGATT-3′，反向5′-GGAACGCTTCACG AATTTG-3′。qRT-PCR體系：10×PCR緩沖液2.5 μl，硫酸鎂(MgSO4)2.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，無核糖核酸酶雙蒸水(RNase-Free ddH2O)補足體系至25 μl；反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環。miR-17-5p、miR-25-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-17-5p、miR-25-3p相對表達量。

1.4隨訪 患者均進行3年隨訪，隨訪方式為電話或復查，統計患者生存時間及生存率。

1.5統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗；受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-17-5p、miR-25-3p對結腸癌的診斷價值；采用Kaplan-Meier對3年生存情況進行分析，Log-Rank法檢測組間生存差異；采用COX比例風險回歸分析影響結腸癌患者預后的相關因素。

2 結 果

2.1結腸癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表達水平 與對照組比較，結腸癌組血清miR-17-5p、miR-25-3p的表達水平升高，差異均有統計學意義(均P<0.001)，見表1。

表1 結腸癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表達水平比較

2.2miR-17-5p、miR-25-3p與結腸癌患者臨床病理參數的相關性 miR-17-5p、miR-25-3p與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度密切相關(P<0.05)，見表2。

表2 miR-17-5p、miR-25-3p與結腸癌患者臨床病理參數的相關性〔n(%)〕

2.3miR-17-5p、miR-25-3p對結腸癌的診斷價值 miR-17-5p診斷的敏感性為78.26%，特異性為76.09%，ROC曲線下面積(AUC)為0.776，95%CI：0.709～0.784；miR-25-3p診斷的敏感性為83.70%，特異性為88.04%，AUC為0.864，95%CI：0.805～0.910，見圖1。

圖1 ROC曲線分析miR-17-5p、miR-25-3p對結腸癌的診斷價值

2.4miR-17-5p、miR-25-3p與結腸癌患者預后的相關性 miR-17-5p高表達組患者生存率(20.31%)顯著低于miR-17-5p低表達組(56.32%)，miR-25-3p高表達組患者生存率(18.35%)顯著低于miR-25-3p低表達組(58.62%)，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 miR-17-5p、miR-25-3p與結腸癌患者預后的相關性

2.5影響結腸癌患者預后的相關因素 miR-17-5p、miR-25-3p、淋巴結轉移、分化程度是影響結腸癌患者預后的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響結腸癌患者預后的相關因素

3 討 論

miRNA可通過調控靶基因表達而調節細胞增殖、遷移及侵襲等，從而參與結腸癌發生及發展過程，既往研究顯示miRNA可作為結腸癌診斷及評估患者預后的重要指標〔7～9〕。但仍有部分miRNA在結腸癌發生及發展過程中的作用尚未完全闡明。

miR-17-5p在胰腺癌中呈高表達并可通過促進細胞周期進展從而增強胰腺癌的增殖〔10〕。敲低miR-17-5p表達可通過靶向10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)而抑制甲狀腺癌增殖，促進細胞凋亡〔11〕。miR-17-5p通過抑制netrin 4表達從而促進乳腺癌細胞遷移及侵襲〔12〕。研究表明miR-17-5p在膀胱癌患者血清中表達上調，并可作為膀胱癌早期診斷及判斷患者預后的重要指標〔13〕。本研究結果顯示結腸癌患者血清miR-17-5p的表達水平隨著結腸癌TNM分期、淋巴結轉移及分化程度的增加而顯著升高，提示miR-17-5p可能參與結腸癌發生及發展過程。本研究采用ROC曲線分析miR-17-5p對結腸癌的診斷價值，結果顯示miR-17-5p診斷結腸癌的敏感性與特異性較高，提示miR-17-5p對結腸癌具有一定診斷價值。

miR-25-3p通過調節PTEN/蛋白激酶B(Akt)途徑而促進視網膜母細胞瘤的惡性表型〔14〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)小核仁RNA宿主基因(SNHG)5通過調控miR-25-3p/B細胞易位基因(BTG)2分子軸而促進子宮內膜癌的進展〔15〕。LncRNAGATA6反義RNA1(GATA6-AS)通過下調miR-25-3p表達從而抑制胃癌細胞的增殖〔16〕。相關報道指出miR-25-3p高表達可促進胰腺癌發生及發展〔17〕。本研究結果顯示miR-25-3p在結腸癌患者血清中呈高表達，其表達量與患者TNM分期、淋巴結轉移、分化程度密切相關，提示miR-25-3p在結腸癌發生及發展過程中發揮重要調控作用。本研究采用ROC曲線分析miR-25-3p對結腸癌的診斷價值，結果顯示miR-25-3p的敏感性與特異性較高，提示miR-25-3p在結腸癌早期診斷中具有一定應用價值。本研究采用COX比例風險模型分析影響結腸癌患者預后的相關因素，結果顯示miR-17-5p、miR-25-3p、淋巴結轉移、分化程度是影響結腸癌患者預后的危險因素，提示miR-17-5p、miR-25-3p表達量升高預示結腸癌患者預后不良。

綜上所述，結腸癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表達水平顯著升高，二者表達量均與患者臨床病理參數密切相關，并可能作為結腸癌診斷及判斷患者預后的重要指標。但關于miR-17-5p、miR-25-3p在結腸癌發生及發展過程中的作用機制仍需進行體外細胞實驗與體內實驗進行驗證。