產前診斷中額外小標記染色體的臨床及遺傳學分析*

李燕青，傅婉玉，王元白，江矞穎，蘇景明，莊建龍

福建省泉州市婦幼保健院/兒童醫院產前診斷中心,福建泉州 362000

額外小標記染色體(sSMC)是指不能通過細胞遺傳學常規顯帶方法辨認的染色體結構畸變，其大小通常等于或小于同一個中期染色體核型中的20號染色體[1]。sSMC的表型效應取決于它的來源、片段大小和常染色質所占比例。由于sSMC本身形態結構異常，無法用傳統G顯帶技術判斷其來源，而分子遺傳學檢測能協助判斷sSMC的來源,為臨床咨詢提供更精準有益的信息。本研究對泉州市婦幼保健院/兒童醫院產前診斷中心經產前羊水細胞培養及染色體核型分析檢出sSMC的病例進行分析，并對部分病例采用單核苷酸多態性微陣列(SNP-array)檢測sSMC的來源，以進一步明確其致病性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年3月于泉州市婦幼保健院/兒童醫院產前診斷中心就診的高危孕婦5 766例。產前診斷納入指征包括高齡孕婦(≥35周歲)、胎兒超聲檢查結果異常、有不良孕產史、孕中期血清學產前篩查高風險等。所有孕婦均有詳細的病歷資料和體格檢查資料，并完善術前檢查排除穿刺手術禁忌證，同時簽署知情同意書。本研究經泉州市婦幼保健院/兒童醫院醫學倫理委員會批準(倫理審批號：2020No.31)。

1.2細胞培養及染色體核型分析 在超聲引導下行羊膜腔穿刺術，抽取20 mL羊水用于羊水細胞培養，培養7～10 d后用胰酶消化法進行細胞收獲，通過自動染色體收獲系統Sinochrome Chromprep Ⅱ(上海樂晨生物科技有限公司)進行染色體制備，經吉姆薩染液染色后進行核型分析。采集夫妻雙方外周血標本于無菌條件下接種至Chromed P細胞培養基中，分兩瓶培養68～72 h后分別收獲、制片、染色、染色體核型分析。羊水細胞計數30個核型，并分析5個核型。外周血細胞計數20個核型，并分析5個核型。染色體的命名依據人類細胞基因組學國際命名體系(ISCN 2016)標準。

1.3SNP-array檢測 采集孕婦10 mL羊水標本及夫妻雙方外周血標本各3 mL送至第三方檢測公司(北京貝康醫學檢驗所)進行檢測，離心收集沉淀，采用DNA提取試劑盒提取羊水/外周血細胞基因組DNA，經稀釋消化、擴增、純化后，形成25 bp的片段。將芯片上的探針與生物素標記后的相應堿基片段進行雜交、洗滌、結合染色后放入Affymetrix公司GeneChip Scanner 3000Dx v.2 with AutoLoaderDx掃描儀進行掃描，采用Chromosome Analysis Suite(ChAS)v4.0軟件對熒光信號進行分析。通過數據庫查詢判讀拷貝數變異(CNVs)的致病性。

1.4統計學處理 采用Excel 2010進行數據收集和分析。

2 結 果

2.1羊水染色體核型分析結果 檢出sSMC的胎兒共7例，其中嵌合型3例，1例伴有18-三體綜合征，見表1。

表1 檢出sSMC胎兒的羊水染色體核型、SNP-array檢測結果、父母驗證及妊娠結局

2.2SNP-array檢測結果 7例檢出sSMC的胎兒中有4例進行了SNP-array檢測，其中2例sSMC分別來源于X和Y染色體,2例未檢出CNVs。病例1中羊水染色體核型提示mos45，X[27]/46，X，+mar[23]，SNP-array檢測結果顯示為男性胎兒，該胎兒在性染色體Y上的擬常染色體區域存在2處缺失，因此羊水染色體核型更正為mos45，X[27]/46，X，del(Y)(q11.221)[23]。病例2 SNP-array檢測結果顯示為女性胎兒，X染色體存在3處缺失，羊水染色體核型更正為45，X[35]/46，X，del(X),(Xp11.22q13.3)。病例3和病例4 SNP-array檢測結果未見異常，見表1。

2.3妊娠結局及父母驗證 病例1及病例2經SNP-array檢測提示胎兒性染色體嵌合異常，均為致病性變異，父母驗證無異常，顯示胎兒攜帶的sSMC為新發突變。病例1于妊娠26周引產一男性無生機兒，外觀未見明顯異常；病例2引產一女，外觀未見明顯異常。病例3及病例4因SNP-array檢測未發現異常CNVs，均選擇繼續妊娠，后期隨訪胎兒體健。此外，3例未行SNP-array檢測的病例中有1例因合并胎兒18-三體綜合征選擇終止妊娠；1例因合并胎兒復雜型先天性心臟病選擇終止妊娠；1例因父母驗證提示胎兒sSMC遺傳自其表型正常的父親，孕婦及其家屬選擇繼續妊娠，后期隨訪顯示胎兒出生后未見異常。見表1。

3 討 論

據報道，約1 000例行染色體核型分析的羊水穿刺標本中就可檢出1例存在sSMC的病例[2]。sSMC的遺傳效應差異很大，大多數對個體無影響，但也有10%～15%可導致嚴重智力低下和其他異常表型，明確sSMC來源對臨床產前咨詢尤其重要[3]。

SNP-array檢測有助于明確sSMC來源[4-5]。本研究中2例通過SNP-array檢測明確sSMC為性染色體來源的致病性變異，病例1羊水染色體核型為mos45，X[27]/46，X，+mar[23]，SNP-array檢測結果提示sSMC來源于部分缺失的Y染色體，最終病例1羊水染色體核型更正為mos45，X[27]/46，X，del(Y)(q11.221)[23]。胎兒Y染色體存在涉及無精癥因子(AZF)區段及Y染色體性別決定區(SRY)等OMIM基因相關區域的2處缺失，同時胎兒在Xq28或者Yq12區段存在291.8 Kb的缺失，在Xp22.33或Yp11.32區段存在包含SHOX等基因的2.2 Mb的嵌合缺失。SHOX基因的單倍劑量不足會導致身材矮小[6]。位于Y染色體短臂遠端的SRY基因在胚胎早期原始性腺組織分化過程中起著關鍵作用，SRY基因的缺失可能導致性器官發育異常[6]。徐丹萍等[7]總結相關文獻報道發現，嵌合型Y染色體長臂大片段缺失的存活個體中，34.8%(8/23)存在身材矮小的情況(原因尚不明確)，大部分男性患者存在陰莖結構正常但伴有尿道下裂。病例1存在涉及Y染色體的多處缺失，不僅影響胎兒的性別及生長發育，還會影響其成年后的生育問題，因此孕婦及家屬選擇終止妊娠。

胎兒NT增厚與染色體異常和部分結構畸形密切相關[8]。病例2因胎兒NT增厚要求進行產前診斷，羊水染色體核型為45,X[35]/46，X，+mar[15]，SNP-array檢測明確該sSMC為部分缺失的X染色體，羊水染色體核型更正為45,X[35]/46,X,del(X),(Xp11.22q13.3)。在45,X基礎上發生的sSMC并不影響Turner綜合征表型[9]。研究表明，約32.6%的嵌合型Turner綜合征患者中有一些自發的青春期發育表現，但最終繼發閉經，其可能與Xq13-q26區域缺失導致卵巢功能相關基因的單倍劑量不足有關，臨床表型為卵巢功能障礙、性腺發育障礙、原發閉經等，需要長期激素替代治療[10-11]。

產前診斷中發現的sSMC是否有表型效應，與sSMC的染色體來源、基因組含量、家族再發性，是否為嵌合型和嵌合度，是否存在單親二倍體效應等因素有關[12-15]。本研究中病例7因胎兒sSMC遺傳自其表型正常的父親，推測胎兒出現異常表型的風險低，建議孕婦繼續妊娠,后期隨訪顯示胎兒出生后健康狀況良好。約30%的sSMC遺傳自父母，由表型正常的父親或母親傳遞而來的sSMC通常不增加子代異常表型的風險[16]，因此首先建議對胎兒的父母進行染色體核型分析,幫助判斷胎兒的sSMC來源[9]。

sSMC大部分來源于近端著絲粒染色體[17-18]。本研究中病例3及病例4的SNP-arry檢測結果均未發現異常，提示sSMC來源于探針未覆蓋的異染色質區，來源于異染色質區的sSMC通常是不致病的[17]。

sSMC形態學的多樣性，如何評價其對胎兒的影響，以及是否需要終止妊娠等，是產前遺傳咨詢面臨的重要問題，盡快明確sSMC的來源尤為重要，因此將分子遺傳學與細胞遺傳學方法相結合對明確sSMC的來源及致病性有重要意義，可為產前遺傳咨詢及妊娠結局評估提供參考。