siRNA干擾下調DJ-1的表達對人支氣管上皮細胞生物學行為的影響*

魏旺麗,譚 潭,崔亞娟,劉國棟

1.湖南省郴州市第一人民醫院檢驗醫學中心，湖南郴州 423000;2.中南大學湘雅二醫院血液內科,湖南長沙 410011;3.湖南省郴州市第一人民醫院南院急診科，湖南郴州 423000

DJ-1又稱帕金森病相關蛋白7(PARK7)，是已知的帕金森病相關蛋白[1]，位于染色體1p36.23，相對分子質量為20×103，長度為24 kb,屬于肽酶C56蛋白家族成員。DJ-1在很多組織中廣泛表達，如肝臟、骨骼肌、腎臟等， DJ-1作為眾所知周的致癌因子，在腫瘤的發生和發展中也起著至關重要的作用[2-3]。DJ-1在很多腫瘤中都有過表達現象，如乳腺導管癌、非小細胞肺癌等[4]。DJ-1的功能很多，包括轉錄調節、抗氧化應激等[5]。DJ-1的抗氧化應激功能可有效保護神經細胞免受氧化應激的損傷，促進神經細胞生長及增殖。DJ-1是已知的肺癌轉移相關蛋白[6]，為研究DJ-1對細胞生物學行為的影響，本研究選擇人支氣管上皮細胞(HBE細胞)作為研究對象，探討低表達DJ-1對HBE細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 實驗室保存的HBE細胞；DJ-1 siRNA慢病毒載體、Control siRNA慢病毒載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胎牛血清(FBS)、1640培養基等購自美國賽默飛世爾公司。

1.2方法

1.2.1分組 構建DJ-1基因siRNA慢病毒載體,感染HBE細胞(DJ-1 siRNA組)，并設置Control siRNA慢病毒載體對照(Control siRNA組)及空白對照(BC組)。

1.2.2流式細胞術檢測各周期細胞 消化收集的細胞，洗滌離心后用70%乙醇重懸細胞，制成1×106/mL的細胞懸液；于4 ℃冰箱中過夜固定后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入100 μL核糖核酸酶A(RNase A)，37 ℃水浴30 min；加入碘化丙啶(PI)染液400 μL，4 ℃避光放置30 min后采用流式細胞儀檢測各周期細胞。

1.2.3MTT比色法檢測細胞增殖情況 消化收集的細胞，梯度稀釋成1×104/mL的細胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔培養板，共接種4塊板，每組每板接種20孔。此外，A1孔中加入200 μL完全培養基作為空白對照，再在其他15個空白孔中加入200 μL無菌PBS以保證試驗結果的穩定性和可靠性。于接種后24、48、72、96 h各選1塊培養板進行檢測，各實驗孔及空白對照孔中加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃培養4 h后去除孔內液體，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)各150 μL，于酶標儀上快速振蕩60 s充分溶解孔內沉淀后，在570 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值。

1.2.4克隆形成試驗檢測細胞克隆情況 消化收集的對數生長期細胞，吹打制成單個細胞懸液，每組分別以每孔200個細胞接種于6孔培養板中。2周后肉眼可見的克隆出現后終止培養，棄上清液后用PBS洗滌2次,加入4%多聚甲醛2 mL放置15 min固定細胞。去固定液，吉姆薩染液染色10～30 min后流水緩慢沖洗，自然干燥。隨機選取6個視野，分別計數每個視野下單個細胞形成克隆(細胞數>5個)的數量。

1.2.5Transwell小室試驗檢測細胞遷移情況 消化收集的對數生長期細胞，調整細胞水平至(0.5～1.0)×106/mL。將500 μL含10%FBS的培養基加入24孔板下室中；侵襲小室內加入細胞懸液300 μL。孵育48 h后去除侵襲小室內未穿過基底層膜的細胞；4%多聚甲醛固定，結晶紫染色20 min；沖洗掉多余的染色液后自然干燥；隨機選取不同視野(×100)并計數細胞個數。

2 結 果

2.1DJ-1下調對HBE細胞周期的影響 流式細胞術檢測結果顯示，DJ-1 siRNA組、Control siRNA組、BC組細胞周期為G1期的細胞分別占65.80%、20.57%和22.44%；S期細胞分別占 16.39%、31.56%和30.35%；G2期細胞分別占17.81%、47.87%和47.21%。與Control siRNA組相比，DJ-1 siRNA組的G1期細胞比例增高45.23%,而S期和G2期細胞比例分別減少15.17%、30.06%。DJ-1 siRNA組G1期細胞比例高于BC組、Control siRNA組，S期、G2期細胞比例低于BC組、Control siRNA組，差異有統計學意義(P<0.05)，BC組、Control siRNA組各周期細胞比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2DJ-1下調對HBE細胞增殖的影響 采用MTT比色法檢測3組細胞增殖情況，結果顯示，與Control siRNA組和BC組比較，DJ-1 siRNA組在接種后24、48、72、96 h的A值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。DJ-1 siRNA組在接種后48、72、96 h的增殖抑制率分別是36.9%、60.8%和37.6%。

表1 3組細胞接種后不同時間點A值比較

2.3克隆形成試驗結果 采用克隆形成試驗檢測3組單個細胞的克隆形成情況，結果顯示，DJ-1 siRNA組、Control siRNA組和BC組的克隆數分別為(8.00±1.67)、(12.50±2.17)個和(11.50±1.52)個，DJ-1 siRNA組的克隆數明顯少于Control siRNA組與BC組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 3組單個細胞培養2周后的鏡下圖(×100)

2.4DJ-1下調對細胞遷移能力的影響 Transwell小室試驗結果顯示，DJ-1 siRNA組、Control siRNA組及BC組遷移細胞數分別為(44.7±2.1)、(50.3±1.5)、(51.3±1.2)個，與Control siRNA組、BC組比較，DJ-1 siRNA組的遷移細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，而BC組和Control siRNA組遷移細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 3組遷移細胞鏡下圖(×100)

3 討 論

DJ-1廣泛存在于人胰腺、腎、肌肉、肝臟等多種器官及組織的細胞中。DJ-1含有189個氨基酸殘基及3個半胱氨酸(Cys)殘基，其中Cys-106為活性位點。研究發現，DJ-1不僅與帕金森病密切相關，而且在很多腫瘤中都存在過表達現象，因此其可能在腫瘤的發生和發展過程中起著重要作用[1-3]。DJ-1與肺鱗癌的發生、發展密切相關，DJ-1是一種高度保守的蛋白，在肺鱗癌中高表達，促進癌細胞分裂、增殖、遷移、侵襲。DJ-1的作用機制復雜，涉及細胞轉錄調控、氧化應激等多種病理、生理過程。

本研究通過下調DJ-1的表達抑制了HBE細胞的分裂、增殖、遷移、侵襲，可能涉及的DJ-1作用機制有以下幾點：(1)調節人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)信號通路。DJ-1可以通過抑制PTEN的活性來拮抗細胞凋亡，從而促進細胞增殖，使得PTEN/PI3K/Akt信號通路的活性增強[7-8]。(2)參與抗氧化應激。DJ-1含有3個可被氧化的Cys位點，分別是Cys-46、Cys-53、Cys-106，其中Cys-106為活性位點，可被氧化突變為丙氨酸后喪失抗凋亡能力，調節核因子E2相關因子(Nrf2)信號通路的轉錄過程，參與抗氧化應激[9-10]。

正常的細胞周期進程是細胞增殖的前提。本研究采用流式細胞術檢測下調DJ-1表達后的HBE細胞周期變化，結果表明，下調DJ-1表達后HBE細胞的細胞周期發生明顯變化，細胞阻滯于G1期(與Control siRNA組相比，DJ-1 siRNA組的G1期細胞比例增高45.23%)，S期與G2期細胞數量顯著減少，細胞有絲分裂受阻。MTT比色法檢測細胞增殖情況，結果顯示，DJ-1 siRNA組在接種后48、72、96 h的增殖抑制率分別是36.9%、60.8%和37.6%，表明下調DJ-1的表達會抑制HBE細胞的增殖。克隆形成試驗結果顯示，DJ-1 siRNA組的克隆數明顯少于Control siRNA組與BC組(P<0.05)，表明下調DJ-1的表達能夠抑制HBE單個細胞的克隆，進一步證實抑制DJ-1 的表達會抑制HBE細胞增殖。結合細胞周期檢測結果，表明細胞有絲分裂受阻導致了細胞增殖能力減弱。Transwell小室試驗檢測結果顯示，與Control siRNA組、BC組比較，DJ-1 siRNA組的遷移細胞數明顯減少，表明下調DJ-1的表達后HBE細胞的體外遷移和侵襲能力減弱。

DJ-1參與調節細胞的生長周期，在細胞的分裂、增殖、遷移、侵襲中起到了重要作用。筆者前期的研究表明，DJ-1作為促癌因子加速了細胞周期進程，促進了肺鱗癌細胞系(SK-MES-1細胞)的侵襲與遷移[11]。結合本研究結果，表明DJ-1作為促癌因子，不僅在肺鱗癌細胞的生長、增殖過程中起作用，而且可能在HBE細胞的生長、增殖過程中也起到重要作用。目前，DJ-1的作用機制尚未完全明確，因此對DJ-1的不斷深入研究可加深人們對帕金森病以及腫瘤發生、發展、轉移等的認知，為臨床治療提供新的研究方向。