基于JAK/STAT信號通路探討連花清瘟顆粒對甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠肺組織的保護作用及機制*

樊高薇,薛敬東,李警卓

陜西省中醫醫院急診科，陜西西安 710003

作為威脅人類健康的傳染性疾病之一，流行性感冒(簡稱流感)不僅發病率高，同時還有高傳染率、高病死率的特點，尚不能得到有效控制。我國是流感高發國家之一，我國流感病死率較高，1997年暴發的H5N1流感病死率高達66%～80%[1]；2009年新型甲型H1N1流感暴發，因其發病急，傳播范圍廣，影響了全球200多個國家和地區；目前流感的治療方式主要為抗病毒治療，疫苗接種的保護率低，且成本較高[2-3]。甲型H1N1流感病毒已經成為引起重癥肺炎的病原體之一，而且甲型H1N1流感病毒感染導致的重癥肺炎往往容易進展為急性呼吸窘迫綜合征[2-4]，因此，開展抗甲型H1N1流感病毒藥物的研究仍具有重要意義。臨床常將連花清瘟顆粒用于上呼吸道感染的治療，在新型冠狀病毒肺炎疫情發生后，連花清瘟顆粒也被用來預防及治療新型冠狀病毒肺炎，并且取得了較好的治療效果，其可以廣譜抗病毒，通過調節多種信號通路抑制病毒對細胞的侵襲。研究發現，在甲型H1N1流感病毒入侵機體的早期，機體會應激產生干擾素，干擾素可與細胞膜特異性受體(IFNAR)結合[5]，激活Janus激酶(JAK)/信號轉導及轉錄激活因子(STAT)信號通路，使肺炎加重[6]，本研究旨在基于JAK/STAT信號通路，探究連花清瘟顆粒對甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠肺組織的保護效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1標本來源 SPF級4～6周齡雌性BALB/c小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK(粵)2019-0035，動物質量合格證號為44007200052444。甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2儀器與試劑 連花清瘟顆粒購自石家莊以嶺藥業股份有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄-PCR試劑盒購自Thermo Fisher公司；實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購自TaKaRa公司；4%多聚甲醛購自Sigma公司；乙醚購自國藥化學試劑有限公司；高效RIPA組織裂解液、蛋白酶抑制劑、BSA封閉液、ECL化學發光試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠IgG檢測試劑盒(ELISA)購自南京建成生物工程研究所；蛋白檢測試劑盒(BCA法)購自北京索萊寶科技有限公司；JAK1、STAT3酶標兔多克隆抗體購自Sigma公司。二級生物安全柜購自Thermo Fisher公司；BSA223S電子天平購自Sartorius公司；ABI 7500 Real-Time PCR儀購自Applied Biosystems公司；倒置顯微鏡購自Leica公司；垂直電泳儀、半干轉印儀購自Bio-Rad公司；全自動數碼凝膠/化學發光圖像分析系統購自上海天能科技有限公司；超純水儀購自ELGA公司；組織勻漿機購自天根生化科技(北京)有限公司；Tecan Infinite?200 Pro多功能酶標儀購自Tecan公司；CUT5062型石蠟旋轉式切片機購自SLEE公司；電熱恒溫鼓風干燥箱購自Thermo Fisher公司。

1.3方法

1.3.1甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠模型的建立 將病毒原液稀釋至1、10、100、1 000、10 000倍，每個稀釋倍數對應10只小鼠，通過滴鼻感染小鼠，每只小鼠感染病毒量為20 μL，觀察10 d后各組小鼠的存活情況。另取25只小鼠，每個稀釋倍數對應5只，通過滴鼻感染小鼠，感染5 d后將小鼠用乙醚麻醉，然后摘下眼球，盡量流干血液，斷頸處死，解剖后取出全肺，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后吸干表面水分，稱取肺濕重，60 ℃烘箱內放置24 h，稱取肺干重，根據肺濕干重比評價小鼠肺水腫情況，肺濕干重比值越大，肺水腫越嚴重。同時，取5只小鼠納入NC組，用同體積的生理鹽水滴鼻，5 d后稱取肺干重、濕重，計算肺濕干重比。根據造模病毒稀釋倍數選擇原則，模型鼠應選擇有較低存活率(低于50%)，同時肺濕干重比顯著高于NC組的小鼠。

1.3.2分組及給藥干預 將30只小鼠隨機分為模型組(H1N1組)、連花清瘟顆粒組(LC組)、對照組，每組10只。將H1N1組、LC組小鼠用乙醚輕度麻醉后，用1.3.1確定稀釋倍數的造模病毒液滴鼻感染小鼠，對照組用同體積的生理鹽水滴鼻。根據連花清瘟顆粒的說明書，按5 g/kg的給藥劑量，將連花清瘟顆粒溶解后對LC組小鼠進行灌胃給藥5 d，然后再進行H1N1流感病毒液滴鼻造模，感染5 h后繼續給藥5 d；在LC組給藥的同時，對照組、H1N1組灌胃同體積生理鹽水。

1.3.3小鼠健康狀態觀察 自感染病毒后，觀察H1N1組、LC組、對照組小鼠健康狀態，包括毛發是否順滑，精神狀態，是否有咳嗽、呼吸困難等。

1.3.4肺組織JAK1、STAT3 mRNA表達水平檢測 感染病毒后5 d，將H1N1組、LC組、對照組小鼠用乙醚麻醉后進行解剖，取小鼠右肺組織約3 cm3，迅速放入無菌EP管中，液氮處理15 min，轉移至-80 ℃保存備用。根據RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，根據反轉錄-PCR試劑盒說明書進行反轉錄，得到cDNA，用qPCR檢測JAK1、STAT3 mRNA的表達水平，內參基因為β-actin。JAK1正向引物5′-GCCAGTGCCCTGAGTTACTT-3′，反向引物5′-GTCTGGATCTTGCCTGGTCA-3′；STAT3正向引物5′-TGTGTGACACCATTCATTGATGC-3′，反向引物5′-TGCCCAGATTGCCCAAAGAT-3′。反應體系：qPCR SuperMix 10 μL，正向引物、反向引物各0.4 μL,cDNA模板1 μL,加純水至反應體系總體積為20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。用2-ΔΔCt方法計算表達水平。

1.3.5肺病理組織觀察 取LC組、H1N1組、對照組小鼠左肺組織約3 cm3(避免鑷子劃傷組織)，將組織固定于4%多聚甲醛內，24 h后更換多聚甲醛，按照常規方法對組織進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色(HE染色)，顯微鏡下觀察病理變化。

1.3.6肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平檢測 稱取對照組、LC組、H1N1組小鼠肺組織各50 mg，加入300 μL提前配制的組織裂解液，勻漿機內充分攪勻，10 000×g離心10 min，吸取上清液，采用BCA法檢測蛋白，調節水平至100 mg/mL，SDS-PAGE電泳后進行轉膜，BSA封閉液封閉，孵育抗體，采用化學發光(ECL)試劑盒檢測JAK1、STAT3蛋白表達水平。

1.3.7血清IgG水平檢測 將對照組、LC組、H1N1組小鼠摘取眼球后取血，4 ℃冰箱內靜置過夜，11 800×g離心10 min，吸取上清液，按照小鼠IgG檢測試劑盒(ELISA)說明書檢測血清IgG水平。

2 結 果

2.1不同稀釋倍數病毒液感染后小鼠存活率變化 感染10 d后，NC組無死亡，存活率為100%；稀釋倍數為1的病毒液感染的小鼠全部死亡，存活率為0%；稀釋倍數為10、100的病毒液感染的小鼠存活率均為10%；稀釋倍數為1 000的病毒液感染的小鼠存活率為20%；稀釋倍數為10 000的病毒液感染的小鼠存活率為70%，根據小鼠存活率，可將10、100、1 000作為造模備選稀釋倍數。

每天統計不同稀釋倍數病毒液感染小鼠和NC組小鼠的死亡數，稀釋倍數為1的病毒液感染的小鼠第5天開始出現死亡，存活率持續下降，第9天存活率為0%；稀釋倍數為10、100、1 000的病毒液感染的小鼠第6天開始出現死亡，存活率持續下降；稀釋倍數為10 000的病毒液感染的小鼠第7天開始出現死亡，存活率一直保持較高水平，見圖1；因此，可在病毒感染第5天，保證小鼠未死亡的前提下觀察各項指標。

圖1 不同稀釋倍數病毒液感染的小鼠及NC組小鼠存活率變化情況

2.2不同稀釋倍數病毒液感染5 d后小鼠肺濕干重比 感染5 d后，與NC組比較，稀釋倍數為1、10、100的病毒液感染的小鼠肺濕干重比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。根據造模病毒稀釋倍數選擇原則，最終選用稀釋倍數為100的病毒液進行造模，見表1。

2.3小鼠健康狀態觀察 對照組小鼠毛發順滑、光亮，精神狀態正常，無咳嗽、呼吸困難；H1N1組小鼠毛發凌亂、暗淡，精神萎靡，伴有咳嗽、呼吸困難；LC組小鼠毛發凌亂、暗淡，精神萎靡，但咳嗽癥狀相較于H1N1組有所改善。

表1 不同稀釋倍數病毒液感染5 d后小鼠肺濕干重比與NC組比較

2.43組肺組織JAK1、STAT3 mRNA的表達水平比較 與對照組比較，H1N1組、LC組JAK1、STAT3 mRNA表達水平明顯升高，而相較于H1N1組，LC組JAK1、STAT3 mRNA表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.5肺組織病理學變化 對照組小鼠肺組織正常，見圖3A；H1N1組小鼠肺組織出現充血、水腫現象，同時發生彌漫性炎癥細胞浸潤，伴有上皮細胞脫落、壞死，發現支氣管上皮細胞變形，見圖3B；LC組小鼠相較H1N1組小鼠肺組織水腫、充血現象減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，肺部病變得到緩解，但仍有局部肺泡間隔增厚，見圖3C。

注：A為3組JAK1 mRNA表達水平比較；B為3組STAT3 mRNA表達水平比較；*P<0.05。

注：A為對照組小鼠典型肺組織切片HE染色結果；B為H1N1組小鼠典型肺組織切片HE染色結果；C為LC組小鼠典型肺組織切片HE染色結果。

2.63組肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平比較 與對照組比較，H1N1組小鼠肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而LC組小鼠肺組織JAK1、STAT3蛋白表達水平略高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4、5。

2.73組血清IgG水平比較 H1N1組小鼠血清IgG水平[(2.75±0.55)ng/mL]明顯高于對照組[(1.15±0.23)ng/mL]，LC組小鼠血清IgG水平為(8.44±0.68)ng/mL，明顯高于對照組、H1N1組，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：A為3組肺組織JAK1蛋白表達水平比較；B為3組肺組織STAT3蛋白表達水平比較；*P<0.05。

圖5 3組肺組織JAK1、STAT3蛋白Western blot圖

3 討 論

使用連花清瘟顆粒治療流感具有一定效果。有研究發現，服用連花清瘟顆?？捎行У挚辜仔虷3N2流感病毒感染，發揮預防作用[7]；還有研究以甲型H1N1流感病毒感染的BALB/c小鼠為研究對象，發現服用奧司他韋與連花清瘟顆粒均對感染小鼠的肺指數提升有明顯的抑制作用[8]。通過查詢PubChem數據庫，發現連花清瘟顆粒在體內發揮作用時可涉及細胞對外部刺激反應的抑制、細胞凋亡、細胞信號傳導等方面相關的140個靶蛋白，相關蛋白主要為蛋白激酶B、胱天蛋白酶3、絲裂原活化蛋白激酶1、腫瘤因子P53等[9]。同時研究發現，連花清瘟顆?？商岣咝∈篌w內CD4+水平，可提高小鼠血清干擾素-γ的表達，增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能，從而提高小鼠免疫功能[10]。臨床研究發現，連花清瘟顆粒可緩解患者咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀，對流感的治療效果好，尤其在發病早期可以明顯減輕患者臨床癥狀，且效果優于一般中成藥；而在治療甲型H1N1流感病毒感染方面，連花清瘟顆粒效果顯著，不良反應少，安全性更高，同時還可作為預防用藥[11-14]。本研究結果顯示，使用連花清瘟顆粒干預后，甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀得到改善，肺組織切片鏡檢顯示炎癥細胞浸潤明顯減少，水腫及充血現象得到緩解，說明連花清瘟顆粒可有效保護小鼠肺組織。同時，LC組小鼠血清IgG水平為(8.44±0.68)ng/mL，明顯高于對照組、H1N1組，提示使用連花清瘟顆粒治療可以增強小鼠免疫功能。

探討連花清瘟顆粒治療甲型H1N1流感病毒性肺炎的相關機制具有重要意義。JAK/STAT通路在甲型H1N1流感病毒性肺炎的進展中起著重要作用[5-6]。JAK1、STAT3蛋白是JAK/STAT信號通路的主要蛋白，研究發現，脾臟中具有豐富的JAK1、STAT3蛋白，一旦JAK/STAT信號通路被激活，可直接及間接促進腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的產生，導致炎癥發生[15-16]。此外，STAT3的高表達直接參與了皮膚病的發生，如有研究發現，銀屑病患者STAT3蛋白的表達顯著上調[17]；蕁麻疹患者JAK/STAT信號通路被激活，經過有效治療后，STAT3 mRNA表達水平顯著下降，基因沉默JAK/STAT信號通路后，患者炎癥癥狀減輕[15,18]。JAK1是非受體酪氨酸激酶；STAT3是STAT家族一員，參與癌細胞的活化與增殖[19]。有研究指出，抑制STAT3的表達后，線粒體內氧化磷酸化活性被抑制，組胺分泌減少，因此，近年來STAT3常作為研究過敏性疾病治療的新靶點[20]。本研究觀察小鼠肺組織JAK1、STAT3的基因轉錄及表達水平發現，采用連花清瘟顆粒干預后甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠肺組織JAK1、STAT3 mRNA表達水平均明顯降低，提示該藥物可能通過抑制JAK/STAT信號通路發揮增強小鼠免疫力，降低炎性反應水平，保護小鼠肺組織的作用。連花清瘟顆粒在抗流感病毒感染方面有強大功效，在體外實驗中還可抑制流感桿菌，而且由于作用靶點多，所以不易產生耐藥性，其聯合奧司他韋治療對降低乙型流感病毒感染小鼠肺指數的作用優于奧司他韋單獨治療[21]。

綜上所述，連花清瘟顆粒可以抑制甲型H1N1流感病毒性肺炎小鼠體內JAK/STAT信號通路，增強小鼠免疫力，減少小鼠肺組織損傷。