基于雞蛋清制備的多孔支架用于組織工程軟骨構建的實驗研究

賈子豪 李豪 徐勇 周廣東 譚曉燕 張偉

軟骨缺損臨床極為常見，但治療方法有限。近年來，組織工程技術為軟骨缺損的修復提供了新的途徑。在組織工程軟骨中，支架材料具有關鍵作用，選擇一個合適的支架材料十分重要。

目前，組織工程軟骨支架材料包括天然高分子材料、人工合成材料和復合支架材料[1-3]。雖然材料來源眾多，但每種材料都存在某些不足。天然材料具有良好的生物相容性，來源廣泛，價格低廉，是近年來研究的熱點。以蛋白質為主的天然生物材料已被廣泛應用于生物醫學領域。

雞蛋蛋白具有天然無毒、生物相容性好、無明顯炎癥反應、人體易于降解等特點，且來源豐富、成本低廉。蛋清的主要成分包括：卵清蛋白、卵鐵傳遞蛋白、卵類黏蛋白和溶菌酶。其中，卵鐵傳遞蛋白和溶菌酶具有很強的抗菌性。研究表明，卵清蛋白和卵類黏蛋白具有刺激肌母細胞增殖，以及促進肌管生長的作用[4-5]。以上特性表明，蛋清可用于制備生物材料。

本研究擬將雞蛋清與去離子水混合后通過冷凍干燥制備成多孔支架，探索其孔隙率及力學性能；將兔耳軟骨細胞接種于該種支架后進行體外培養，以探究該支架用于制備組織工程軟骨的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

胰蛋白酶、高糖DMEM 培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、磷酸鹽緩沖液（Hyclone 公司，美國）。

掃描電鏡（SU8010，日立公司，日本），生物力學分析儀（Instron 公司，美國），CCK-8 檢測試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）。

1.2 蛋清材料的制備

取適量生雞蛋，分離蛋清后攪勻。將蛋清與去離子水以1:0、1:1 和1:2 的體積比分別制備蛋清材料，冷凍干燥后備用。

1.3 蛋清材料的SEM 表征

將不同體積比的蛋清材料，用2.5%戊二醛4 ℃下固定24 h，然后用pH 7.4 的PBS 緩沖液沖洗后，1%鋨酸4 ℃條件下固定4 h，再用梯度乙醇脫水，CO2干燥器干燥、噴金、黏托，電鏡觀察蛋清材料的微觀結構，并通過電鏡圖片計算其孔隙率。

1.4 生物力學檢測

將蛋清樣本剪成0.5 cm×1 cm 的長方形小塊，置于壓縮測試儀上，沿垂直樣本方向以1 mm/min的速度壓縮，直到樣本組織變形，計算楊氏模量。

1.5 種子細胞的獲取與擴增

取兔耳軟骨，洗凈，切成1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入5 倍體積的0.25%膠原酶搖床消化過夜；100 μm 孔徑濾網過濾，1 500 r/min 離心5 min，PBS漂洗2 遍，以含10%FBS 的高糖DMEM 配成細胞懸液，按2×106個/皿（直徑10 cm 培養皿）接種細胞，置入5%CO2、37 ℃培養箱培養。細胞達90%融合時傳代。取第2 代軟骨細胞用于后續實驗。

1.6 活死細胞染色

將經環氧乙烷消毒的三種不同體積比的材料，制成直徑5 mm 圓形膜片放入24 孔板中，加入濃度為100×106cells/mL 的軟骨細胞懸液6 μL，置于5%CO2、37 ℃培養箱培養，4 h 后加入含10%FBS 的高糖DMEM 培養液至覆蓋復合物后繼續培養。分別于第1、4、7 天進行活死細胞染色?；钏兰毎旧噭┖惺褂貌襟E：先根據說明書配置活死細胞染色檢測工作液；吸去樣品中培養基后加入200 μL 的Live/Dead 檢測工作液，室溫避光孵育15 min；吸去染液后用無菌PBS 清洗3 遍，加入1 mL 的PBS 溶液，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 細胞增殖率檢測

將經環氧乙烷消毒的直徑5 mm 的圓形蛋清材料放入24 孔板中，加入濃度為100×106cells/mL 的軟骨細胞懸液6 μL，置于5%CO2、37 ℃培養箱培養，4 h 后加入含10%FBS 的高糖DMEM 培養液至覆蓋復合物后繼續培養。分別于第1、4、7 天，向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，繼續孵育。4 h 后將24孔板里的溶液輕輕吸除，移到96 孔板中，多功能酶標儀檢測450 nm 處的吸光度。

1.8 組織學檢測

取兔耳軟骨細胞，接種于不同體積比的蛋清支架材料，體外培養3 周后取出，脫水、石蠟包埋，切片（厚度5 μm），HE 染色，觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。

1.9 統計學分析

數據統計采用GraphPad Prism 軟件（Version 5.00，GraphPad Software，美國），數據以（）表示，組間比較采用非配對t 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同體積比蛋清材料形態觀察及其孔徑對比

三種不同體積比支架大體觀無明顯區別，材料均質，外形規則，成形較好。掃描電鏡顯示，隨著去離子水比例增加，蛋清材料孔徑逐漸增加。定量分析顯示，體積比為1:0、1:1 和1:2 的蛋清材料孔徑大小分別為（79.2±10.9）μm、（177.6±17.5）μm 和（282.8±19.7）μm（圖1）。

圖1 蛋清支架大體及電鏡觀察Fig.1 Gross and SEM Observation of egg white scaffolds

2.2 力學性能檢測

楊氏模量檢測顯示，去離子水比例的增加，使支架材料的力學強度逐漸下降。體積比為1:0、1:1 和1:2的材料楊氏模量分別為（66.6±7.2）KPa、（46.2±8.3）KPa和（28.4±4.6）KPa（圖2）。

圖2 三種不同體積比蛋清支架楊氏模量對比（*：P＜0.05）Fig.2 Young's modulus comparison of scaffolds with three different volume ratios (*：P＜0.05)

2.3 活死細胞染色與細胞增殖率檢測

結果顯示，在接種軟骨細胞后的第1～7 天，軟骨細胞在三種蛋清支架中均增殖良好。隨著去離子水比例的增加，軟骨細胞黏附在蛋清支架上的細胞量明顯增加。CCK-8 檢測細胞增殖結果亦與此相符（圖3）。

圖3 活死細胞染色與細胞增殖率檢測Fig.3 Living &dead cell staining and cell proliferation assay

2.4 體外軟骨構建

三種不同體積比蛋清支架接種軟骨細胞后，經體外培養3 周，HE 染色顯示軟骨細胞外基質結構基本形成。隨著去離子水含量的增加，殘余的材料量越來越少，而新生的軟骨基質成分越來越多（圖4）。

圖4 體外軟骨再生Fig.4 In vitro cartilage regeneration

3 討論

近年來，軟骨損傷發病率呈增高趨勢，而軟骨本身無血管、淋巴管分布，一旦損傷很難自行修復?，F有的軟骨損傷修復方法，如自體或者異體組織（骨膜、軟骨膜）移植等，存在來源有限、供區損傷、二次手術、容易引起免疫反應等諸多不足之處。

組織工程技術的快速發展為解決這一難題提供了新的思路。制備組織工程軟骨，支架材料具有關鍵作用，也是目前限制組織工程軟骨臨床轉化的關鍵難點[6-8]。軟骨組織工程支架材料主要包括天然生物材料、人工合成高分子材料和復合材料等三大類。理想的支架材料應具有以下特點：來源廣泛，易于獲取，成本低廉，良好的生物相容性，適宜的孔隙率，一定的力學強度，利于種子細胞黏附和生長等。常用的合成材料主要包括聚乳酸、聚羥基乙酸等。但是這些合成材料生物相容性差，且降解產物為酸性，易引起免疫排斥反應，無法真正用于臨床。天然生物材料具有良好的生物相容性，免疫原性低且降解產物不會引起排斥反應，與正常組織細胞外基質結構成分相似，并且來源廣泛，具有非常良好的應用前景。

以蛋白質為主的生物支架材料具有無細胞毒性、生物相容性好、易于降解等特點，被廣泛應用于組織工程領域。蛋清中含有多種類型的蛋白質。蛋清支架與傳統支架相比其優勢在于[9-10]：①生物相容性好，不會引起強烈的免疫排斥反應；②易吸收降解；③蛋清中含有卵鐵傳遞蛋白和溶菌酶，有很強的抗菌性，可抑制細菌生長，且卵清蛋白和卵類黏蛋白具有刺激肌母細胞增殖和促進肌管生長的作用[11-13]；④來源廣，價格低，制備工藝簡單易行。因此，本研究將雞蛋清這種價格低廉、來源廣泛、生物相容性良好、易于人體降解的材料制備成組織工程軟骨支架。

良好的支架材料需滿足以下要求[14-15]：①有良好的生物相容性，無細胞毒性，無致畸性；②有多孔的三維立體結構，且孔徑大小須符合細胞生長要求，為細胞黏附、生長、營養成分的滲入以及代謝產物的排出提供有利條件；③生物可降解性，且降解形成的產物也不具備細胞毒性；④具有可塑性和一定的機械強度。為了滿足以上要求，我們通過探索蛋清與去離子水的比例來調整支架的孔徑大小與力學強度，使其符合軟骨的生長條件。研究發現，組織工程軟骨構建的適宜孔徑大小應該在50～300 μm[16]。隨著去離子水比例的增加，孔徑隨之增加。定量分析顯示，體積比為1:0、1:1 和1:2 的蛋清材料孔徑大小分別為（79.2±10.9）μm、（177.6±17.5）μm 和（282.8±19.7）μm。因此，基于蛋清制備的支架材料孔徑完全符合軟骨組織工程的要求。另外，隨著去離子水比例的增加，蛋清支架的力學強度隨之下降。今后需要根據不同軟骨構建模型摸索出適宜的蛋清與去離子水的混合比例，以平衡孔徑大小與力學強度的需求。

理想的軟骨組織工程支架材料需要滿足的另一個條件是具有良好的細胞相容性。蛋清是一種天然材料，重要成分為蛋白質，已被證實適合多種細胞的黏附及生長[17-18]。我們在制備蛋清支架材料的過程中，僅加入了去離子水，對其細胞相容性沒有任何影響。通過體外培養后，活死細胞染色與細胞增殖實驗結果也證實，軟骨細胞均能在三種比例的蛋清材料上黏附、增殖和生長。隨著去離子水比例的增加，蛋清材料的孔徑也在增加，所接種的軟骨細胞數量也有所增加。

本研究中最核心的問題在于以蛋清材料為支架，是否能真正構建新的組織工程軟骨。我們將軟骨細胞與蛋清支架復合物體外培養時間延長到3 周，HE 染色顯示，三種蛋清支架均有稚嫩的新生軟骨基質成分形成。我們還發現，隨著去離子水比例的增加，殘余的材料量越來越少，而新生的軟骨基質成分越來越多。可以猜測，隨著培養時間的延長，新生的軟骨基質成分會進一步成熟至出現典型的軟骨陷窩成分，并且殘余材料也會隨著降解而越來越少。

綜上所述，通過調節雞蛋清與去離子水的混合比，可以制備出具有適宜孔隙大小及一定力學強度的多孔支架。蛋清支架具有良好的細胞相容性，延長體外培養時間可以構建出新生的軟骨組織。雞蛋清有潛力成為一種理想的組織工程軟骨支架材料。今后，我們將進行蛋清支架的體內軟骨構建，進一步觀察蛋清支架的體內長期轉化情況，為軟骨組織工程提供一種新型的支架材料。