促黑曲霉產糠醛和五-羥甲基糠醛的誘導子篩選及優化

丁 軒，劉建蕊，楊青青，冉 麗，鄭姚佩，田 羽，韋永琴，劉維芳，李 祝

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

糠醛(Furfural)是一種重要的生物質平臺化合物，其分子結構中含有呋喃環和醛基，化學性質活潑，可作為多種化學產品的起始原料，廣泛應用于醫學、食品、化工、能源等領域。張素等、趙妗頤等試驗發現黑曲霉xj菌株粗提物中對齊整小核菌和鏈格孢菌具有拮抗作用的物質可能是糠醛，說明糠醛可能具有抑菌作用。目前生產糠醛主要是酸水解法，戊糖經酸催化環化脫水形成，而大多含有戊糖的物質都可作為原材料生產糠醛。五-羥甲基糠醛(5-Hydorxymethylfurfural，簡寫為5-HMF)，因其具有呋喃環、醛基及羥基，所以穩定性差、性質活潑，是一種重要的平臺化學物。可通過縮合反應、氧化反應、氫化反應和縮醛等反應，合成多種具有高附加價值的衍生物如2,5-二呋喃甲醛(DFF)、五-酰基糠酸(HMFCA)等。5-HMF的眾多衍生物可作為有機導體、生物燃料，在醫藥方面具有抗癌細胞增值活性，降血糖等藥理作用。馬明超等展示了許多制備5-HMF的方法，其中葡萄糖轉化制備 5-HMF的方法達到72%的產率。雖然目前生產糠醛和5-HMF的方法眾多，但仍存在產率較低、生產資源浪費等情況。

黑曲霉()屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科，是絲狀真菌中一個常見真菌。具有生長旺盛、發酵周期短、不產生毒素等特點，屬于GRAS菌種，是應用于食品工業上發酵和生產酶制劑的主要菌種。黑曲霉的基因組中發現了大量與次級代謝有關的基因簇，可以產生多種次級代謝產物，關麗萍等在海洋真菌2HL-M -8的發酵液中發現11個黑曲霉的次級代謝產物。因其具有高產、高分泌、高安全性等優點而被廣泛地應用于發酵工業中，其中黑曲霉已被用于規模化大量發酵生產檸檬酸。

目前提高次級代謝產量的方法主要有菌株選育、發酵優化、微生物共培養。誘變選育菌株包含化學誘變、物理誘變以及復合誘變。在誘變選育中常使用2種以上的誘變方法復合誘變提高誘變效應；發酵優化為發酵培養基成分的優化和培養條件的優化；而微生物共培養發酵可以使活性粗提取物增加、促進次級代謝產量的提高以及誘導新的次級代謝物的合成，還可誘發原次級代謝物的類似物的共同途徑。除以上三種提高次級代謝產物的方法外，目前誘導子也廣泛應用于提高次級代謝產量。

誘導子(Elicitor)最初定義為可誘導植物細胞產生和積累植保素的化學物質，但隨著誘導子的應用領域擴大，發現誘導子是一類可以特異激活植物或微生物產生次生代謝產物的活性物質。目前誘導子已廣泛應用于提高植物中次級代謝產物的產量且誘導機制較成熟透徹。而誘導子在微生物方面的應用主要是關于促進納他霉素的產量，試驗發現產黃青霉代謝產物誘導子和黑曲霉代謝產物誘導子對產納他霉具有較好的促進作用。目前將誘導子用于提高黑曲霉次級代謝產量的研究很少見，本試驗主要利用誘導子來提高黑曲霉產生次生代謝產物—糠醛和5-HMF的產量，以便為后續的黑曲霉發酵產糠醛和5-HMF提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試驗菌種

黑曲霉()xj,由貴州大學真菌資源研究所分離，現于中國典型培養物保藏中心保存(CCTCC No：M206021)。

培養基及試劑

馬鈴薯液體培養基(PDB)；馬鈴薯固體培養基(PDA)；LB培養基；0.1%吐溫-80溶液。

1.2 試驗方法

誘導子的制備

1.2.1.1 誘導子類型

本次試驗以10種生物誘導子(表1)和6種非生物誘導子CuSO、苯甲酸鈉、氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸為篩選目標。

表1 生物誘導子的類型

1.2.1.2 非生物誘導子的制備

參考聶麗的試驗方法，將上述非生物誘導子配成濃度為10 μg/mL的溶液，經0.45 μm濾膜后得到的溶液即為非生物誘導子。

1.2.1.3 生物誘導子的制備

采用凍融研磨法制備生物誘導子。除微生物的培養方式不同外，其余步驟與聶麗相同，改動如下。

真菌誘導子:用打孔器分別將鏈格孢菌()、煙草疫霉()、齊整小核菌()制成菌餅后，分別接種到PDB 培養基(100 mL/250 mL)中，于28 ℃，180 r/min 培養7 d，其中齊整小核菌28 ℃靜止培養7 d，過濾收集菌體。將收集的菌體參照聶麗的凍融研磨法制備誘導子，后置于4 ℃冰箱中備用。

細菌誘導子:分別將青枯雷爾氏菌()、根癌農桿菌()、巨大芽孢桿菌()、胡蘿卜軟腐歐文氏菌()接種到LB培養基(100 mL/250 mL)中30 ℃，150 r/min培養2 d；大腸桿菌()、枯草芽孢桿菌()、金黃色葡萄球菌()接種到LB培養基中，于37 ℃，180 r/min培養2 d，10000 r/min離心10 min 收集菌體。收集到的菌體同真菌誘導子制備方法一致。

1.2.1.4 生物誘導子還原糖含量的測定

以還原糖含量作為生物誘導子質量濃度的指標，采用3,5 一二硝基水楊酸(DNS)比色法測定其還原糖含量。參照趙凱等試驗利用DNS比色法測定還原糖濃度，選取DNS試劑2在波長為550 nm處測定。

黑曲霉種子液的生長曲線

將活化的黑曲霉接種于PDA培養基中，于26 ℃、150 r/min恒溫培養箱中培養5 d，用適量的0.1%吐溫-80無菌溶液洗下孢子。參照袁洪威等的試驗方法用分光光度計測定黑曲霉孢子懸浮液濃度。制備濃度為10CFU/mL孢子懸浮液，以6%的接種量加入種子培養基(50 mL/250 mL)中。培養8 d，每24 h取樣測定菌體干重。

發酵液中糠醛和5-HMF含量的測定

1.2.3.1 建立糠醛和5-HMF標準曲線模型

試驗方法參照彭秋菊等和張素等用HPLC法測定黑曲霉發酵液中五-羥甲基糠醛和糠醛的含量，建立糠醛和5-HMF的標準曲線。

1.2.3.2 發酵液中糠醛和5-HMF含量的測定

參照彭秋菊等和張素等用HPLC法測定黑曲霉發酵液中糠醛和5-HMF的含量。稍有改動，改動如下：將斜面培養基中的黑曲霉活化，制成10CFU/mL孢子懸浮液，將孢子懸液以8%～12%(V/V)接種于發酵瓶中培養7 d。發酵液處理方法以及色譜條件與彭秋菊等試驗一致。

誘導子篩選及優化

主要以發酵液中糠醛含量為評價指標，將處于對數生長末期的種子液按6%的接種量加入發酵培養基(50 mL/250 mL)中，在此基礎上進行單因素試驗設計。

1.2.4.1 誘導子種類及最佳添加時間的篩選

將濃度為10 μg/mL的氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸和濃度為10 μmol/mL的CuSO和苯甲酸鈉，還原糖濃度為10 μg/mL的生物誘導子以1%的添加量，在誘導時間為72 h的條件下，添加時間設為0 d、3 d、5 d，測糠醛和5-HMF的含量。以糠醛含量為指標，篩選最佳誘導子及最佳添加時間。以不添加誘導子為空白對照。

1.2.4.2 誘導子添加量的篩選

在誘導子為10 μg/mL SAE，添加時間為0 d，誘導時間為72 h的條件下，添加量設為1%、2%、4%、6%、8%、10%，測糠醛和5-HMF含量。

1.2.4.3 誘導子誘導時間的篩選

在添加量為1%的10 μg/mL SAE，添加時間為0 d的條件下，誘導時間設為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h,測糠醛和5-HMF含量(誘導時間從誘導子加入后開始計算，而發酵時間針對空白對照，包含添加時間)。

響應面優化發酵條件

根據單因素試驗結果，選取最佳條件作為0因素水平，設計三因素三水平的Box-Behnken試驗(表2)。利用Design-Expert軟件設計Box-Behnken試驗方案，以黑曲霉發酵液中的糠醛產量為響應指標進行響應面分析，預測誘導子在黑曲霉發酵體系中的最佳誘導條件。(因為最佳添加時間為0 d，左邊已是極值，故選用1d為0水平)

表2 Box-Behnken試驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 還原糖的標準曲線

利用DNS法測定還原糖濃度(即生物誘導子質量濃度)。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，OD值為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，其線性回歸方程為=04957-00088(=0.998)，葡萄糖含量在0～1.2 mg之間，具有良好線性關系。

2.2 黑曲霉在種子培養基中的的生長曲線

將濃度為10CFU/mL孢子懸浮液以6%的接種量接入種子培養基，裝液量為50 mL/250 mL。由圖1可知，經過3 d培養后菌種生物量最大，即將進入穩定期，可將對數生長期末期(3 d)的培養液作為種子液，進行發酵試驗。

圖1 黑曲霉種子液生長曲線Fig.1 Growth curve of A. niger seed solution

2.3 糠醛和五羥甲基糠醛的標準曲線

利用HPLC法測定糠醛和5-HMF的標準曲線，其中糠醛的標準曲線線性回歸方程為=57582+19582(=0.999)。5-HMF的標準曲線線性回歸方程為=72107-11357(=0.999)。兩個方程在0～60 μg/mL濃度范圍具有良好線性關系。

2.4 誘導子種類及誘導時間篩選

分別向已培養0 d、3 d、5 d的發酵培養液中添加10種生物誘導子及6種非生物誘導子。其中非生物誘導子對于黑曲霉的作用效果不明顯，但生物誘導子有較明顯的作用效果。綜合圖2-4來看，相比于CK培養基液中的糠醛產量，0 d添加的ATFE、SAE、AAE、PNE具有促進作用。其中SAE的誘導效果最佳，其余誘導子對糠醛產量均表現為抑制作用,其中PNE對菌體的生長也具有抑制作用；在3 d時添加誘導子均表現為促進作用；在5 d時添加誘導子較0 d糠醛的產量減少。可知0 d添加SAE效果顯著優越，糠醛含量達47.44 μg/mL，較空白對照(CK)提升了19.18 μg/mL；5-HMF含量達38.59 μg/mL，較空白對照提高了16.50 μg/mL。故選擇最佳誘導子為SAE，最佳添加時間為0 d。

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著，下同。圖2 0 d添加誘導子時不同誘導子對黑曲霉產生糠醛和5-HMF的影響Fig .2 Effects of different elicitors on the production of furfural and 5-HMF by A. niger when elicitors were added on 0 day

圖3 3 d添加誘導子時不同誘導子對對黑曲霉產生糠醛和5-HMF的影響Fig.3 Effects of different elicitors on the production of furfural and 5-HMF by A. niger when elicitors were added on the third day

圖4 5 d添加誘導子時不同誘導子對對黑曲霉產生糠醛和5-HMF的影響Fig.4 Effects of different elicitors on the production of furfural and 5-HMF by A. niger when elicitors were added on the fifth day

2.5 誘導子最佳添加量的篩選

在誘導子為10 μg/mL SAE，添加時間為0 d，誘導時間為72 h的條件下，添加量按1%、2%、4%、6%、8%、10%與黑曲霉種子液一起加入發酵液中，測定糠醛和5-HMF的含量。由圖5可知，1%的添加量產生糠醛含量較高，其余濃度對產糠醛影響不大，故選取1%為最佳添加量。

圖5 添加不同濃度的誘導子對黑曲霉產生糠醛影響Fig.5 Effects of adding different concentrations of elicitors on furfural production by A. niger

2.6 誘導子最佳誘導時間的篩選

在添加量為1%的10 μg/mL SAE，添加時間為0 d的條件下，誘導培養12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h(從加入誘導子時間開始計算)。由圖6可知，誘導子時間為12 h對促進黑曲霉產生糠醛含量最大達到53.22 μg/mL；5-HMF含量達42.46 μg/mL。故最佳誘導時間為12 h。

圖6 不同誘導時間對黑曲霉產生糠醛影響Fig.6 Effect of different induction times on furfural production of A. niger

2.7 響應面法優化誘導條件

響應面的模型建立與統計分析

確定單因素的最佳值后，進行Box-Behnken試驗，以發酵液中的糠醛(Y)的產量為響應值,誘導子的添加時間(A)、添加量(B)以及誘導時間(C)為變量，進行響應面優化試驗，結果如表3所示。

表3 響應面優化數據

根據表3的試驗結果，利用Design Expert 8對數據進行回歸分析,得到糠醛的回歸方程：Y=42.71-13.2A-0.15B-1.09C+0.47AB+1.01AC+0.59BC-5.66A-1.02B-7.73C。

表4 糠醛的回歸方程分析結果

響應面分析及優化

利用Design Expert根據回歸方程進行響應面分析，尋找糠醛產量最大的誘導條件。響應面的陡峭程度可以表明變量對因變量的影響程度，響應面越陡峭說明相關因素影響效果越明顯。由圖7可知，三個因素對黑曲霉產糠醛的影響表現為：添加時間(A)>誘導時間(C)>添加量(B)。對模型進行分析，得到最優的培養條件：添加時間為0 d、添加量為0.675%、誘導時間為8.6 h，此條件下的糠醛含量理論值為50.52 μg/mL。根據給出的最佳培養條件設計試驗進行驗證(設置三組平行試驗)得出發酵液中糠醛的實際含量分別為50.51、50.47、50.48 μg/mL，與預測值較為接近，說明此模型可以較好地預測誘導條件下的糠醛產量。而在糠醛的最佳誘導條件下發酵液中5-HMF的實際產量也達到了41.12 μg/mL。

圖7 糠醛添加時間與添加量、添加時間與誘導時間及添加量與誘導時間的響應面與等高線圖Fig.7 The response surface and contour map about furfural addition time and amount,addition time and induction time,and addition amount and induction time

3 結論與討論

用誘導子提高微生物次級代謝的產量，不僅與黑曲霉自身的發酵特性有關，還跟誘導子的種類、誘導子的含量、添加時間和誘導時間有密切的關系。聶麗等試驗表明細菌誘導子內的活性成分主要是多糖類物質和蛋白質，并且在誘導鏈霉菌合成農抗702時也是細菌誘導子具有較好的誘導效果。結果顯示，對黑曲霉發酵作用最好的誘導子為金葡萄球菌代謝產物，是一種細菌代謝產物誘導子，說明細菌代謝產物誘導子對微生物產次生代謝產物具有一定的作用效果，但對于SAE內的具體有效物質還是未知的。在確定最佳誘導子后，觀察誘導子的含量、添加時間和誘導時間對其誘導效果的影響。本試驗在添加濃度為1%時產糠醛量最大，但隨著誘導子的含量增加，出現產糠醛含量較高的添加量。有人將誘導子含量與次生代謝產物的產量的關系概括為飽和型和最適型，最適型可以解釋本試驗的情況。本試驗的最佳添加時間是將種子液與金葡萄球菌代謝產物誘導子一同接入發酵培養基，即為0 d，表明在對數生長期末期時加入誘導子，次生代謝產物產量較多。在邊猛試驗中利用sp.代謝產物誘導子作用于海洋真菌，結果表明將真菌培養至對數生長期末期加入誘導子，產生的次生代謝產物含量最高，這與本試驗的結果一致。關于誘導子最佳添加時間出現的情況，可能是由于在真菌培養早期合成糠醛和5-HMF的關鍵酶前體物質不足，導致早期加入誘導子無法激活關鍵酶的活性，而在對數生長期末期關鍵酶前體物質充足，受到誘導子的刺激導致關鍵酶活性增強，次生代謝產物含量增多。對于不同的誘導時間，在12～48 h內誘導子具有明顯的促進效應，說明在發酵初期誘導子的作用效果較明顯。但是隨著誘導子的誘導時間推移，糠醛產量降低，誘導子的作用效果不顯著。而在64 h后出現空白對照的含量高于樣品組，可能是由于前期發酵大量消耗了培養基中的成分，導致添加誘導子的樣品后期次生代謝產物較空白組少。

響應面優化法優化發酵條件具有優化速度快，預測結果偏差小等優點。目前，已有報道將響應面優化法應用于發酵條件的優化以及誘導子篩選等方面。如彭秋菊等用響應面優化黑曲霉產糠醛的培養基條件較優化前糠醛產量提高了20.2%；魏寶東等利用響應面法優化促進納他霉素合成的誘導子誘導條件，經優化后納他霉素產量提高了1.68倍。以上試驗說明響應面優化法對于發酵具有較好的優化效果。本試驗利用經單因素試驗確定了誘導子的種類、誘導子添加時間、誘導量及誘導時間的范圍后，利用Box-Behnken試驗并結合響應面優化篩選出黑曲霉產糠醛最佳條件為：糠醛的添加時間為0 d、添加量0.675%，誘導時間8.6 h。在此條件下培養黑曲霉發酵液中糠醛含量為50.49 μg/mL，較空白對照(36.84 μg/mL)提高了37%；5-HMF的含量為41.12 μg/mL，較空白對照(32.08 μg/mL)提高了31%。