腦震寧顆粒安神藥隊(duì)改善腦震蕩模型小鼠學(xué)習(xí)記憶與空間認(rèn)知能力的實(shí)驗(yàn)研究

王曉英，裴妙榮，趙艷艷

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199）

腦震蕩是常見的輕型顱腦損傷類型，有頭痛、頭暈及程度不一的植物神經(jīng)功能失調(diào)（耳鳴、心悸、血壓波動(dòng)、多汗、性功能下降等）、注意力渙散、記憶力減退、情緒不穩(wěn)容易激動(dòng)等表現(xiàn)，以傷后即刻出現(xiàn)定向障礙或者意識障礙，傷后24 h內(nèi)出現(xiàn)平衡功能缺失，傷后48 h內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍及學(xué)習(xí)能力和記憶力減退為其主要癥狀［1］。腦震寧顆粒由活血祛瘀藥隊(duì)：（當(dāng)歸、川芎、牡丹皮、丹參、地黃、地龍）、除煩止嘔藥隊(duì)：（陳皮、竹茹）、安神益智藥隊(duì)（柏子仁、酸棗仁、茯苓）共11味中藥經(jīng)科學(xué)提取加工制成，共奏涼血活血、化瘀通絡(luò)、益血安神、寧心定智、除煩止嘔之效。臨床使用腦震寧顆粒治療腦震蕩效果頗佳，我們對該方進(jìn)行拆方，應(yīng)用于腦震蕩模型小鼠，觀察各組動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，從而探求腦震寧顆粒組方的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物與儀器 4周齡ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量（18～22）g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK（晉）2015-0001。自制小鼠腦震蕩制造儀；Morris水迷宮（BW-MWM101，上海軟隆科技發(fā)展有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 腦震寧顆粒（山西振東安特生物制藥有限公司出品，批號：Z14021119，10 g/袋）；0.9%氯化鈉注射液（山東華魯制藥有限公司，250 mL，2.25 g/瓶，批號：C07020410）；當(dāng)歸、川芎、茯苓、酸棗仁（炒）、地黃、地龍、陳皮、柏子仁、牡丹皮、竹茹、丹參由山西振東安特生物制藥有限公司提供，與腦震寧顆粒（批號：Z14021119）原料一致，經(jīng)裴香萍教授鑒定為合格品。

1.2 方 法

1.2.1 給藥樣品制備 腦震寧顆粒全方：腦震寧顆粒加蒸餾水配置成0.85 g/mL的灌胃液。腦震寧去酸棗仁、柏子仁、茯苓（實(shí)驗(yàn)1組）：全方去酸棗仁、柏子仁、茯苓，按腦震寧顆粒制備方法制備顆粒劑，配置成0.59 g/mL的灌胃液。腦震寧去酸棗仁（實(shí)驗(yàn)2組）：全方去酸棗仁，按腦震寧顆粒制備方法制備顆粒劑，配置成0.76 g/mL的灌胃液。腦震寧去柏子仁（實(shí)驗(yàn)3組）：全方去柏子仁，按腦震寧顆粒制備方法制備顆粒劑，配置成0.76 g/mL的灌胃液。

1.2.2 造模、分組、給藥 根據(jù)參考文獻(xiàn)［2］，自制小鼠腦震蕩制造儀，采用振動(dòng)法造模：將單只小鼠放入鐵盒內(nèi)，以10次/min左右的頻率用力搖晃，使小鼠撞擊盒子內(nèi)壁造成腦震蕩。造模后觀察并記錄小鼠恢復(fù)自主呼吸及意識障礙等各種反射的時(shí)間，同時(shí)觀察造模后30 min內(nèi)小鼠呼吸及運(yùn)動(dòng)能力等的變化。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：①短暫的意識障礙，30 min內(nèi)恢復(fù)；②短暫的呼吸暫停或減弱，20 s內(nèi)恢復(fù)；③短暫的角膜反射、痛刺激反射，3 min內(nèi)恢復(fù)；④無遺留運(yùn)動(dòng)功能障礙；⑤肉眼及組織學(xué)觀察均無腦挫傷灶［2］。50只造模成功的小鼠納入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組、全方組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組。空白組10只不造模。各給藥組按體重分別灌胃制備好的對應(yīng)藥液，灌胃量為0.2 mL/10 g，空白組和模型組予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)6 d。

1.2.3 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮由圓形水池、可移動(dòng)位置并隱藏在水下面的平臺(tái)、圖像自動(dòng)采集處理系統(tǒng)組成。水迷宮直徑100 cm，水深21 cm，水池內(nèi)壁已做黑色噴塑處理；平臺(tái)直徑9 cm，表面粗糙，內(nèi)壁高度20 cm，肉眼觀察水面無法看清平臺(tái)位置，水溫21～22℃。采用Morris水迷宮定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶和記憶保持能力。給藥6 d，第1天到第5天為有平臺(tái)測試，第6天為撤去平臺(tái)的測試，均于每天給藥1 h后進(jìn)行。

定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第1天到第5天，將小鼠放入水池中（不放平臺(tái)）自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環(huán)境。訓(xùn)練開始時(shí)，將平臺(tái)置于第III象限，將小鼠由第I象限面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到目標(biāo)平臺(tái)所需的時(shí)間和游泳距離，小鼠找到平臺(tái)后或60 s內(nèi)找不到平臺(tái)（潛伏期記為60 s）由實(shí)驗(yàn)者將其拿上平臺(tái)，在平臺(tái)上體息15 s，吹干后放回籠中。

空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天，撤除水下平臺(tái)，隨機(jī)選定一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠均于此處面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)第1次跨越平臺(tái)時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)。圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)自動(dòng)完成數(shù)據(jù)采集及圖像分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

模型組小鼠平均速度、在目標(biāo)象限第Ⅲ象限的路程與停留時(shí)間均較空白組降低（P＜0.05）。上述指標(biāo)全方組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而明顯高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），其中以全方組最高。實(shí)驗(yàn)1組的平均速度及在目標(biāo)象限第Ⅲ象限的路程與空白組接近，在第Ⅲ象限的時(shí)間與模型組接近，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （±s）

表1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （±s）

注:與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

組別平均速度（mm/s）第Ⅰ象限路程（mm）第Ⅱ象限路程（mm）第Ⅲ象限路程（mm）第Ⅲ象限時(shí)間（s）空白組229.17±39.072）3406.30±1326.09 1751.41±479.24 2651.05±763.842）15.92±4.552）模型組187.01±37.911）3579.33±1018.60 2904.41±1497.93 2032.65±327.181）10.28±4.931）全方組238.91±30.223）4356.89±1572.63 2809.36±991.21 2719.65±810.272）11.66±4.94實(shí)驗(yàn)1組227.84±41.83 3097.35±1503.51 2946.79±1490.56 2695.99±817.38 11.78±4.33實(shí)驗(yàn)2組226.07±15.423）3421.64±1320.89 2601.72±1006.82 2665.85±1572.662）11.58±7.15實(shí)驗(yàn)3組240.67±26.173）3723.15±747.86 2976.69±1335.17 2669.97+768.612）12.21±3.162）

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

模型組小鼠平均速度、在目標(biāo)象限第Ⅲ象限的路程與停留時(shí)間、站臺(tái)穿越次數(shù)均明顯低于空白組。全方組、實(shí)驗(yàn)2組上述指標(biāo)均較模型組明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)1組站臺(tái)穿越次數(shù)高于模型組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)3組小鼠平均速度以及在目標(biāo)象限第Ⅲ象限的路程與停留時(shí)間均較模型組增加（P＜0.05）。各給藥組小鼠上述指標(biāo)與空白組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （±s）

表2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （±s）

注:與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

組別平均速度（mm/s）第Ⅲ象限路程（mm）第Ⅲ象限時(shí)間（s）站臺(tái)穿越次數(shù)（次）空白組249.49±45.142）4294.2210±928.09 13.74±6.992）1.80±0.632）模型組197.22±44.781）2982.8256±1250.84 14.99±4.401）1.21±0.921）全方組247.78±15.373）4556.4033±992.82 23.09±5.883）2.51±0.713）實(shí)驗(yàn)1組248.53±29.29 3471.1071±1067.24 17.64±5.56 1.92±1.29實(shí)驗(yàn)2組214.94±18.792）3908.3840±566.75 19.55±3.072）2.30±1.162）實(shí)驗(yàn)3組238.38±43.852）4131.3522±1034.90 19.66±3.062）1.51±0.53

上述結(jié)果表明振動(dòng)法對小鼠造成的空間記憶、工作記憶以及空間辨別能力的損傷明顯，腦震寧全方及其安神藥隊(duì)均能提高小鼠空間記憶、工作記憶以及空間辨別能力。

3 討論

Morris水迷宮由英國心理學(xué)家Morris設(shè)計(jì)，并用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制的研究［3-4］，是目前國際通用的較好的空間辨別學(xué)習(xí)工具。腦損傷動(dòng)物在迷宮中找到隱匿平臺(tái)的時(shí)間越長，表明其認(rèn)知記憶缺失越明顯；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，如果動(dòng)物有良好正常的學(xué)習(xí)記憶能力，則動(dòng)物在原平臺(tái)所在區(qū)域就會(huì)停留較長的時(shí)間，所以我們利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究腦震寧顆粒對腦震蕩小鼠模型的益智作用。

腦震寧顆粒中酸棗仁、柏子仁、茯苓皆為安神類藥物，而安神類藥物對記憶有一定的影響，可以增加GABA（γ-氨基丁酸）含量，對大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀有一定改善，具有腦保護(hù)作用［5-7］。酸棗仁為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujubeMill.）的干燥成熟種子［5-7］，具有寧心、安神等功效，用于治療虛煩不眠、驚悸多夢等癥。黃酮類成分是酸棗仁的主要活性成分之一［2］，除鎮(zhèn)靜催眠外，還具有抗焦慮、抗抑郁、增強(qiáng)記憶力、腦神經(jīng)保護(hù)、抗氧化等多種作用。柏子仁為柏科植物側(cè)柏［Platycladus orientalis（L.）Franco］的種仁，其性平味甘，入心、肝、腎、大腸經(jīng)，具有寧心安神、斂汗生津、潤腸通便之功效［3-4］。茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾寧心等作用，臨床用于水腫、心悸、失眠等。茯苓能改善苯巴比妥鈉所致記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，具有明顯鎮(zhèn)靜催眠作用［8］。各給藥組益智作用由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋耗X震寧全方組＞實(shí)驗(yàn)3組（全方去柏子仁）＞實(shí)驗(yàn)2組（全方去酸棗仁）＞實(shí)驗(yàn)1組（全方去酸棗仁、柏子仁和茯苓）。由此可以推測腦震寧顆粒中酸棗仁、柏子仁、茯苓為改善小鼠腦震蕩后記憶損傷的主要成分，其他藥味也可發(fā)揮協(xié)同作用，而以全方組療效最佳。酸棗仁、柏子仁、茯苓等安神藥隊(duì)及腦震寧顆粒對學(xué)習(xí)記憶影響的機(jī)制，有待深入研究。