復方丹參滴丸通過調控IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路降低內質網應激和自噬保護血管平滑肌細胞

李幸幸,劉 俊,徐忠誠，鄒 晉，董 揚

(1. 浙江省金華市人民醫院心血管內科，浙江 金華 321000；2. 江西省人民醫院江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

目前，心血管疾病是引起我國居民死亡的主要疾病，已成為社會的重要負擔，嚴重威脅人民群眾健康[1]，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引起心腦血管疾病中的重要誘因，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發生表型轉換及增殖異常，遷移和凋亡是影響AS發展的突出表現[2-3]，而VSMCs的病理機制目前尚未闡明。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關的凋亡途徑可能導致了VSMC 增殖和凋亡異常從而在 AS 發生和發展中發揮重要作用[4-5]。此外，在AS中，血管平滑肌細胞存在血管細胞自噬樣特性，適度的血管平滑肌細胞自噬可以減輕氧化應激和抑制細胞凋亡，從而誘導形成穩定斑塊[6-7]。而ERS與自噬過程密切相關，可以誘導細胞發生自噬，但過度激活的自噬反應，能夠促進細胞凋亡[8]。因此，細胞ERS及自噬可能是治療AS的潛在新靶標。中醫藥是治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的特色藥物，中藥復方是治療AS不可或缺的重要藥物之一，復方丹參滴丸是由丹參、三七、冰片3味中藥組成的復方。該方主要適應癥為冠心病和心絞痛，其藥理作用與抑制血管平滑肌細胞增殖相關[9-10]。但其作用是否與調控內質網應激和自噬過程有關目前不得而知，故本研究欲過建立ox-LDL誘導的VSMCs增殖遷移模型，探究復方丹參滴丸對VSMCs內質網應激和自噬的影響，為復方丹參滴丸治療動脈粥樣硬化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1一般資料 選擇2016年2月～2018年5月收治的50例動脈粥樣硬化患者，年齡50～75歲，頸動脈狹窄<50%，患者或其家屬均自愿簽署知情同意書。排除合并嚴重糖尿病和嚴重心肝腎等重要器官病變者，合并凝血功能障礙者，大面積腦梗或合并語言障礙、意識障礙者，妊娠期女性及精神障礙者，合并嚴重的消化系統病變不能耐受藥物治療者，治療依從性差不能堅持配合治療者。將入組患者隨機分為2組：觀察組25例，男15例，女10例；年齡50～73(67.5±5.4)歲。對照組25例，男13例，女12例；年齡51～76(67.3±6.1)歲。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2治療方法 對照組采用西醫治療方案：辛伐他汀(北京四環制藥有限公司，國藥準字H20093221，規格：10 mg)10 mg，每晚睡前口服；阿司匹林腸溶片(山西蘭花藥業有限公司，國藥準字H14023980，規格：0.1 g)0.1 g，每日1次口服，均連續用藥3個月。觀察組在對照組治療基礎上給予復方丹參滴丸(天津天士力制藥集團有限公司，國藥準字Z10950111，規格：27 mg)27 mg,每日3次口服，一次10丸，連續口服3個月。

1.1.3觀察指標 ① 超聲檢測指標：使用彩色多普勒超聲儀檢查左右頸動脈，記錄患者動脈內膜中層厚度(IMT)和斑塊數目及大小，計算斑塊面積，斑塊面積計算方法：測量每個斑塊的3條直徑，選擇直徑最大的2條作為長、寬，相乘得出斑塊面積。② 血液流變學指標：使用血液黏度計檢測2組患者治療前后全血高切黏度、全血低切黏度、血漿比黏度。③凝血功能指標：使用全自動凝血分析儀測定2組患者治療前后血漿纖維蛋白原(FIB)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)及凝血酶時間(TT)。

1.2 材料大鼠胸大動脈平滑肌細胞株(A7r5)，復方丹參滴丸(天津天士力制藥集團有限公司)，內質網應激抑制劑salubrinal(美國Sigma-Aldrich公司，No.324895)和ERS(tunicamycin)誘導劑衣霉素(錸博生化科技有限公司，No. LBH4274)，TRizol試劑(美國Sigma公司，No. T9424)；PowerUp SYBR Green Master Mix(No. A25742)(Thermo Fisher Scientific公司)，新生胎牛血清，DMEM/F12、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，MTT試劑盒(No ST316)、ROS試劑盒(S0033)(上海碧云天生物技術有限公司)，8OHdG試劑盒(上海博湖生物科技有限公司，BH-M99795)，NO試劑盒(A012-1-2)、SOD試劑盒(A001-3-1)、MDA試劑盒(A003-1-1)(南京建成生物工程研究所)，eNOS酶聯免疫試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，YS02062B)，兔抗大鼠Bip/GRP78(ab21685)，ATG5(ab109490)，LC3(ab232940)，P62(ab207305)，bcl-2(ab32124)，bax(ab32503)、caspase-3(ab32351)、IRE1(ab37073))、TARF2(ab126758)、ASK1(ab45178)、p-ASK1(ab278547)、JNK(ab199380)和p-JNK(ab76572)一抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠/兔二抗(上海碧云天生物技術有限公司A0192/A0208)，引物(上海生工生物工程有限公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(天津三箭生物技術有限公司，AO2001-02A-G)，電泳儀(美國BIO-RAD公司)，PCR儀(美國ABI公司)，超微量分光光度計(美國賽默飛公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 將A7r5細胞培養在含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM/F12培養基中，于37 ℃和5%CO2的環境養，定期更換新鮮培養基，待至對數生長期進行細胞傳代，進行后續實驗。

1.3.2分組及干預方法 將對數生長期的血管平滑肌分為對照組、ox-LDL模型組、復方丹參滴丸組，復方丹參滴丸+salubrinal組和復方丹參滴丸+tunicamycin組。ox-LDL模型組給予50 mg·L-1的ox-LDL刺激建立VSMCs增殖遷移模型，復方丹參滴丸組：在模型組基礎上給予1.0 g·L-1的復方丹參滴丸浸膏處理，復方丹參滴丸+salubrinal組：在復方丹參滴丸組基礎上給予50 nmol·L-1的內質網應激抑制劑salubrinal處理，復方丹參滴丸+tunicamycin組：在復方丹參滴丸組的基礎上給予20 nmol·L-1的內質網應激誘導tunicamycin處理。各組均給藥干預3 d。

1.3.3MTT增殖實驗 各組培養3 d后取各組對數期1×103細胞接種于96孔培養板，于培養72 h后，每孔加入20 μL的5 mg·L-1MTT溶液后繼續培養6 h，離心棄去MTT溶液，加入DMSO 150 μL，混勻10 min，應用酶標儀測490 nn處吸光度值，以吸光度值反映活細胞水平，實驗重復3次。

1.3.4NO、SOD、MDA、8OHdG測定 利用硝酸還原酶法按照NO試劑盒說明書測定各組細胞NO含量。

1.3.5eNOS含量測定 按照eNOS酶聯免疫試劑盒說明書進行操作，測定各組細胞中eNOS的含量。

1.3.6ER染色 處理的細胞用ER-tracker Blue-White DPX染料(Molecular Probes)在37 ℃黑暗中染色30分鐘。

1.3.7Western blot檢測蛋白表達 收集各組細胞加入RIPA裂解細胞。離心后取上清置于EP管中放入-80 ℃冰箱保存。依據BCA試劑盒使用說明檢測蛋白濃度。以GAPDH作為內參，將目標蛋白通過SDS-PAGE分離。隨后轉至PVDF膜并常溫封閉1 h后使用TBST清洗，使用Bip/GRP78、ATG5、LC3、P62、bcl-2、bax、caspase-3、IRE1、TARF2、ASK1、p-ASK1、JNK和p-JNK單克隆抗體一抗，在4 ℃冰箱孵育過夜。最后使用辣根過氧化酶二抗(1 ∶5 000)孵育并加入ECL顯色液顯色成像。

1.3.8流式檢測細胞凋亡 對藥物處理后的細胞，加入Annexin V-FITC凋亡檢測試劑，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡結果。

1.3.9免疫共沉淀(CO-IP) 收集VSMCs細胞(1×108L-1)，并用IP緩沖液(P0013，Beyotime)溶解，然后添加超聲波處理。離心后，上清液與兔抗-IgG(1 ∶8 000)、抗-ASK1(1 ∶100)和BeyoMagTMA+G磁珠反應蛋白(P2173，Beyotime)在4 ℃下過夜。抗原抗體蛋白A+G磁珠復合物洗滌后，用SDS樣品緩沖液洗脫結合蛋白。最后，我們用Western blot檢測沉淀蛋白。

2 結果

2.1 兩組患者臨床治療效果比較2組治療后IMT、斑塊數目、斑塊面積均明顯低于治療前(P<0.05)，且觀察組治療后以上檢測指標均明顯低于對照組(P<0.05)(Tab 1)。2組治療后全血高切黏度、全血低切黏度、血漿比黏度均明顯低于治療前(P<0.05)，且觀察組治療后以上血液流變學指標均明顯低于對照組(P<0.05)(Tab 2)。

2.2 各組VSMCs細胞增殖情況使用不同濃度的復方丹參滴丸處理ox-LDL模型細胞，細胞活力檢測后其LD50為5.126 g·L-1。故選用1.0 g·L-1的復方丹參滴丸與其它藥物聯合處理細胞，與對照組相比，ox-LDL模型組吸光度值明顯增加(P<0.05)，而與ox-LDL模型組相比，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則明顯下降，且復方丹參滴丸+salubrinal下降更為明顯(P<0.05)，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸的下降(P<0.05)(Fig 1)。

Fig 1 Effects of different concentrations of Fufang Danshendripping pills on activity of vascular smooth muscle cells (A) and proliferation of vascular smooth muscle cells after different interventions

2.3 各組VSMCs NO含量比較Fig 2顯示，與對照組相比，ox-LDL模型組eNOS和NO含量明顯下降(P<0.05)，而與ox-LDL模型組相比，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則明顯增加，且復方丹參滴丸+salubrinal增加更為明顯(P<0.05)，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸組的下降(P<0.05)。

Fig 2 Comparison of eNOS and NO content of

2.4 各組VSMCs氧化應激水平如Fig 3所示，ox-LDL模型組較與對照組，其中SOD含量顯著降低，而與ox-LDL模型組相比，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則明顯上調，且復方丹參滴丸+salubrinal顯著更為上調，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸組的上調。與對照組相比，ox-LDL模型組MDA、8OHdG和ROS含量明顯增加，而與ox-LDL模型組相比，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則明顯下降，且復方丹參滴丸+salubrinal下降更為明顯，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸組的下降。

Fig 3 Oxidative stress indexes of

2.5 各組大鼠VSMCs內質網應激和自噬標志蛋白表達情況使用ER染色、LC3免疫熒光和ER應激和自噬相關蛋白的免疫印跡來驗證復方丹參滴丸對VSMCs內ER應激和自噬的作用。在ox-LDL模型細胞中，活細胞的典型均勻ER染色模式發生了劇烈變化并呈現陰影，其中常駐熒光脂質易于位于質膜上，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則顯著改善，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸組的改善作用(Fig 4A)。同時，與對照組相比，在ox-LDL模型細胞中，斑點LC3B綠色信號明顯增加，相應自噬蛋白上調(Fig 4B)。復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則顯著降低，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸組的下降。Fig 4C，D顯示，與對照組相比，ox-LDL模型組Bip/GRP78、ATG5、LC3、P62蛋白表達明顯上調，而與ox-LDL模型組相比，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則明顯上調，且復方丹參滴丸+salubrinal上調更為明顯，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸組的下降。

2.6 各組大鼠VSMCs凋亡情況比較對ox-LDL處理后及不同干預的VSMCs凋亡情況進行檢測。ox-LDL模型組細胞較對照組細胞出現明顯的凋亡現象，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則會逆轉ox-LDL對VSMCs造成的凋亡，復方丹參滴丸+tunicamycin組這種逆轉現象減弱(Fig 5A，B)。凋亡蛋白檢測結果顯示(Fig 5C，D)，與對照組相比，ox-LDL模型組bcl-2明顯下調，bax和caspase-3蛋白明顯上調，而與ox-LDL模型組相比，復方丹參滴丸組和復方丹參滴丸+salubrinal組則bcl-2明顯上調，bax和caspase-3明顯下調，且復方丹參滴丸+salubrinal上調或下調更為明顯，復方丹參滴丸+tunicamycin組則明顯逆轉了復方丹參滴丸組的上調和下調。

Fig 4 Expression of endoplasmic reticulum stress and autophagy marker proteins in VSMCs of

Fig 5 Comparison of VSMCs cell apoptosis

2.7 各組大鼠VSMCs內IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路激活情況為了進一步研究復方丹參滴丸與IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的機制，我們進行了共刺激實驗。IRE1招募TNAF2后可以激活ASK1，進而激活JNK信號通路使細胞產生凋亡和自噬[10]。如Fig 6所示，與對照組相比，ox-LDL模型組細胞內IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路被過度激活，在此基礎上，復方丹參滴丸會降低該信號通路的激活，與salubrinal聯用作用細胞后，降低作用更明顯。tunicamycin會減弱復方丹參滴丸的作用。

Fig 6 Activation of

3 討論

隨著生活習慣和生活水平的改變，我國心血管疾病發病率逐年攀升[11]，動脈粥樣硬化是心血管疾病中最為常見的類型之一，在AS病理進程中，VSMC異常增殖、凋亡和表型改變發揮重要作用[12]。因此，抑制VSMC過度增殖和凋亡VSMC可以一定程度上實現延緩AS的作用，AS屬于“胸痹”“中風”“真心痛”等疾病共同發病基礎，屬于本虛標實證候。中藥在調節脂質代謝、抑制VSMC增殖和遷移和調節氧化應激失衡多機理實現防治AS的作用[13]。

復方丹參滴丸由丹參、三七、冰片3味中藥組成。丹參為君，三七為臣，冰片引經上行，為佐使劑，諸藥合用，共奏協同互補之效[14]。藥理學研究表明，復方丹參滴丸中皂苷類成分具有抑制血管平滑肌細胞增殖等保護作用[15]，但其作用機制并未完全闡明。故本研究擬從內質網應激和自噬這兩方面闡述復方丹參滴丸對VSMCs的保護機制。本研究使用ox-LDL誘導大鼠VSMCs增殖模型[15]，隨后采用復方丹參滴進行干預，并為了進一步觀察其對ERS直接調控作用，在復方丹參滴干預基礎上分別聯用ERS抑制劑和誘導劑，觀察不同干預大鼠VSMC遷移、凋亡、氧化應激、ERS及自噬等影響。結果顯示，ox-LDL誘導后，大鼠VSMCs增殖和凋亡明顯異常，NO和eNOS水平明顯下降，說明血管平滑肌的功能受損。氧化應激水平明顯增加，同時ERS標志物Bip/GRP78，以及ATG5、LC3、P62過度表達，表明ox-LDL誘導后ERS和自噬過度激活，整體上呈現病理性特征，模型建立成功，而給予復方丹參滴丸后NO和eNOS明顯升高，氧化應激水平明顯減少，表明其改善了VSMCs血管功能，減輕了氧化應激，同時大鼠VSMCs增殖和凋亡得到明顯抑制，同時Bip/GRP78，以及ATG5、LC3、P62蛋白表達均明顯減輕，表明復方丹參滴丸可以明顯減輕過度激活的ERS和自噬，減輕細胞凋亡和增殖異常，改善了VSMCs血管功能和氧化應激。而在給予ERS抑制劑后，上述指標均呈現更為明顯的改善，表明復方丹參滴丸和ERS抑制劑發揮協同作用。但在給予ERS誘導劑后，均明顯逆轉了復方丹參滴丸的改善作用，呈現此消彼長的趨勢。

在ERS后，細胞將激活許多適應性功能以響應蛋白質折疊的變化，未折疊蛋白的積累會刺激內質網中IRE1的自磷酸化和寡聚化。IRE1是一種跨膜蛋白，在ERS條件下維持細胞存活起著關鍵作用[16]。在ERS期間，IRE1招募TNAF2，TNAF2反過來激活ASK1，最后激活JNK信號通路[17]，從而促進細胞凋亡或自噬。特別是，在接種JNK(c-Jun N端激酶)抑制劑或IRE1缺陷細胞的細胞中，ER應激觸發的自噬受到抑制，表明IRE1/JNK級聯對于刺激ER應激后的自噬是必需的[10]。當ERS的持續時間或程度達到包括自噬在內的細胞適應性機制的極限時，細胞死亡程序就會被激活。細胞凋亡是最常見的細胞死亡方式，總是伴隨著高度的半胱天冬酶激活。半胱天冬酶的激活可導致自噬蛋白的裂解，從而導致自噬程序失活，其目的可能是中止其細胞保護作用并加速細胞死亡[18]，故自噬狀態的初級細胞保護作用未能改善細胞狀態后，則會觸發細胞程序性凋亡。進一步表明，復方丹參滴丸可通過調控ERS維持細胞適當自噬激活程度，減輕了氧化應激，從而抑制細胞過度增殖和凋亡，改善血管功能。為了進一步分析復方丹參滴丸與IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的作用機制，我們進行了系列實驗分析。我們的研究表明，ox-LDL誘導后，大鼠VSMCs內的ERS過度激活，并導致IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活。給予復方丹參滴丸后，降低IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活，維持細胞適當自噬激活程度，而在復方丹參滴丸與ERS抑制劑聯用后，IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活呈現更為明顯的改善，表明復方丹參滴丸和ERS抑制劑發揮協同作用。但在復方丹參滴丸與ERS誘導劑后，均明顯逆轉了復方丹參滴丸的對維持IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路正常激活水平。

綜上所述，復方丹參滴丸通過抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的過度激活，降低內質網應激，維持適當自噬，減輕氧化應激，抑制細胞異常增殖和凋亡，從而保護血管平滑肌細胞。但本研究并未加入自噬調控的誘導劑和抑制劑，并未觀察其對調控自噬對ERS的影響，未進行相互作用的研究，這是下一步研究工作的重點，同時還需在體內動物實驗進行驗證，提供更堅實的實驗依據。