2-羥基-3-甲基蒽醌誘導大腸癌細胞凋亡

李玉花 林金蕊 丘金浪 何則沂

(福州市中醫院檢驗科，福建 福州 350001)

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，具有發病率和死亡率高、5年生存率低等特點〔1，2〕。大腸癌常見的臨床表現有便血、便秘、腹脹、腹痛、食欲減退等。中醫藥采用整體觀念、辨證論治等診療思維，在大腸癌的治療中取得了良好的效果。中醫學將大腸癌歸為“腸癰”“癥瘕”等范疇，中醫認為大腸癌以脾腎虧虛為本虛，以熱毒、瘀血、濕熱為標實〔3，4〕。臨床上常以清熱解毒、活血化瘀、消腫散結等中藥用于治療大腸癌〔5〕。研究證實白花蛇舌草、半枝蓮等清熱解毒類中藥可抑制大腸癌細胞生長，誘導細胞凋亡〔6～8〕，但對白花蛇舌草的內在成分分析和作用機理研究較少。2-羥基-3-甲基蒽醌(HMA)是白花蛇舌草中提取出的一種蒽醌類化合物，研究表明HMA明顯抑制白血病、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細胞增殖〔9～13〕。本研究旨在探討HMA對大腸癌細胞株增殖和凋亡的影響并分析其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 人大腸癌細胞株HCT116和HT-29(中國科學院上海細胞庫)，分別培養在含10%胎牛血清(FBS)的McCoy 5A 培養基中，37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長至融合80%～90%時，胰酶消化傳代。選取處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.1.2實驗試劑 HMA(相對分子質量：238.24，純度>98%，貨號：B50996，用DMSO釋稀配制成200 mmol/L母液，-20℃保存備用，上海源葉生物科技有限公司)；FBS(美國Thermo Fisher Scientific公司)；McCoy′s 5A培養基(江蘇凱基生物有限公司)；青鏈霉素混合液和磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9、caspase-3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)一抗和羊抗兔二抗(美國CST 公司)；CCK-8試劑盒和凋亡試劑盒(武漢Abbkine公司)；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、封閉液、電化學發光(ECL)顯影劑(北京索萊寶有限公司)。

1.1.3主要儀器 CO2培養箱、超凈工作臺(美國Thermo Fisher Scientific公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；Countstar全自動細胞計數儀(美國Countstar公司)；流式細胞分析儀(美國BD公司)；離心機(美國Eppendorf公司)；電泳系統、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測細胞活力 人大腸癌細胞在培養瓶中培養至對數生長期，以3×104個/ml接種于96孔板，過夜培養后，加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)HMA，干預48 h后每孔10 μl CCK-8溶液混勻，培養箱避光孵育2 h，于450 nm波長測定吸光度值。計算HMA對大腸癌細胞的活力，細胞存活率(%)=(實驗組吸光度均值/對照組吸光度均值)×100%。

1.2.2臺盼藍染色細胞計數檢測細胞生長能力 取對數生長期細胞，以1×105/ml細胞接種于12孔板，過夜培養后分別加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)的HMA藥物干預，培養48 h后消化收集細胞，重懸混勻細胞后與0.2%臺盼藍等體積混合，加入計數板中，Countstar全自動細胞計數儀分析細胞總數。

1.2.3集落形成檢測細胞存活能力 取對數生長期細胞，以2×105/ml細胞接種于6孔板，過夜培養后分別加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)HMA藥物干預，培養48 h后消化細胞，以500個/孔接種于12孔板中，連續培養8～12 d，每隔3天換1次液，待肉眼看到集落時終止實驗。棄去12孔板中培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，棄去PBS，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3遍，棄去PBS，加入0.1%結晶紫染液避光室溫染色20 min，PBS清洗3遍，干燥后相機拍照，計算各組集落數。結晶紫染色觀察細胞集落形成情況，集落形成率(%)=(實驗組集落數均值/對照組集落數吸光度均值)×100%。

1.2.4Annexin V單色染色檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，過夜培養后加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)HMA藥物干預，48 h后收集細胞，PBS洗滌細胞2次，離心后取1×106個/ml細胞數，加入100 μl 1×結合緩沖液混勻，分別加入5 μl Annexin V(647 nm波長)混勻，室溫避光反應30 min，待細胞充分結合Annexin V染液，于1 h內流式細胞儀上機檢測，每個樣本至少計數10 000個細胞。

1.2.5Western印跡 按照上述方式HMA干預后收集細胞，PBS洗滌后加入含PMSF裂解液，低溫高速離心后吸取上清液即為所需蛋白。二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度后加入50 μg蛋白量上樣電泳跑膠，將膠上蛋白轉入聚偏氟乙烯(PVDF)膜后室溫封閉1 h，加入不同抗體(1∶1 000)4℃過夜孵育。經TBST清洗后加入對應二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，經TBST洗膜后化學發光顯影拍照。

1.3統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1HMA對大腸癌細胞生長的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25、50、100 μmol/L HMA組細胞存活率及細胞計數均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2HMA對大腸癌細胞存活能力的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25、50、100 μmol/L HMA組集落形成率均顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

2.3HMA對大腸癌細胞凋亡的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25、50、100 μmol/L HMA組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。見表1，圖2。

2.4HMA對大腸癌細胞凋亡相關蛋白的影響 與0 μmol/L HMA組相比，25 μmol/L HMA組HCT116 Bax水平顯著升高，Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)；50、100 μmol/L HMA組HCT116和HT-29細胞酶切caspase-9、酶切caspase-3、Bax水平均顯著升高，Bcl-2水平均顯著降低(均P<0.05)。見圖3，表2。

表1 HMA對HCT116和HT-29細胞存活率及細胞計數的影響

圖1 HMA對HCT116和HT-29細胞集落形成的影響(結晶紫染色)

圖2 HMA對HCT116和HT-29細胞凋亡的影響

表2 HMA對HCT116和HT-29細胞凋亡相關蛋白的影響

3 討 論

大腸癌有惡性程度高、預后差、病死率高等特點〔1，2〕。盡管手術治療仍為大腸癌的首選方案，但大多數就診時已到中晚期，不能手術治療，常以放化療或臨床藥物控制，目前臨床常用藥物存在靶點單一、途徑單一且存在毒副作用，影響患者的生存質量。而傳統中醫藥注重整體調節，在改善患者臨床癥狀、提高機體免疫力，預防腫瘤的復發和轉移等方面發揮重要作用〔3〕。研究報道白花蛇舌草、半枝蓮等清熱解毒類中藥臨床常用于腫瘤、熱癥等疾病治療〔14〕，在體內外實驗均證實對大腸癌生長、轉移等具有明顯的抑制作用〔15，16〕。

細胞凋亡是機體常見的正常生理過程，是生物體細胞在特定信號誘導下、凋亡相關基因調控下發生的一種程序性死亡，作用機制極復雜〔17，18〕。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細胞增殖和凋亡的重要調控蛋白，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax可形成一個調節系統，Bcl-2 通過與Bax 競爭結合形成異源二聚體從而抑制或促進細胞凋亡〔19〕。caspase家族是介導細胞凋亡的蛋白酶系統，在細胞凋亡機制中起到重要調控作用〔20〕，其中caspase-3、caspase-9是caspase家族中參與細胞凋亡的關鍵分子。一般認為caspase-9是參與細胞凋亡的上游分子，而caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的下游終末剪切酶。當caspase-9由于多種因素剪切小片段剪接體部分活化后，引起下游級聯酶活反應，如caspase-3的激活。被激活的caspase-3裂解相應胞質胞核底物，最終導致細胞凋亡〔21〕。Bcl-2、Bax及caspase-9、caspase-3是與細胞凋亡進程密切相關的基因，其中caspase-9、caspase-3和Bax激活促進細胞凋亡，而Bcl-2表現出抑制凋亡作用〔19〕。