不同頻率電針對AD模型大鼠干預及對NMDAR亞基基因表達的影響

王飛 高珊 汪伯毅 胡劍明 沈峰

(1武漢市第一醫院針灸科，湖北 武漢 430022；2湖北中醫藥大學針灸骨傷學院；3武漢市第一醫院中醫部)

阿爾茨海默病(AD)導致患者認知、行為異常，在老年患者中發病率較高，患者主要臨床表現為記憶力減退，認知困難，患者時間、空間定向能力部分喪失，性格寡僻冷漠，精神行為異常〔1〕。針灸治療AD效果顯著，作用機制是降低腦β-淀粉樣蛋白(Aβ)表達，抑制神經元、突觸細胞凋亡，有助于腦源性神經營養因子分泌，對神經元、突觸損傷有一定的修復作用〔2,3〕。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)屬于一種興奮性氨基酸受體，有研究證實，NMDAR在學習、記憶過程中發揮著重要作用〔4〕。本文旨在研究不同頻率電針對AD模型大鼠的干預效果及對NMDAR亞基基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取雄性Wistar大鼠40只，4～5月齡，平均體重350～400 g，均由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。所有大鼠在溫度(22±2)℃，濕度55%環境中喂養1 w。

1.2方法

1.2.1模型建立 40只大鼠稱重后使用10%水合氯醛注射，對大鼠給予腹腔麻醉，大鼠腦立體定位儀固定后，根據《大鼠腦立體定位圖譜》確定大鼠海馬區齒狀回，原點為前囟，向后移動距離3.2 mm，中線旁開距離2.5 mm，向下深度3.5 mm，在大鼠顱骨上使用牙科鉆進行鉆孔〔5〕。使用磷酸鹽緩沖液配置Aβ1～42溶液，濃度為1 μg/μl，在37℃中孵育1 w形成寡聚肽，使用5 μl微量注射器將Aβ1～42溶液注射至大鼠海馬齒狀回，分別在雙側注射5 μl溶液，速度為1 μl/min，在5 min內注射完成，留針5 min促進藥物充分吸收，使用牙托粉將顱骨鉆孔封閉，皮膚縫合后，使用碘酒消毒。假手術組10只大鼠，在大鼠雙側齒狀回區注入5 μl 0.9%無菌生理鹽水，其他與上述模型建立一致。所有建模成功的大鼠腹腔注射4×104U青霉素，連續注射3 d，避免感染發生。

1.2.2電針干預 模型組、2 Hz組、50 Hz組、假手術組，各10只。建模成功15 d后，對大鼠進行干預，選擇大鼠百會穴、腎俞穴進行針刺：使用鼠套將大鼠固定，百會穴進針方式為針尖向前平刺，針刺角度保持15°，距離5 mm；腎俞穴進針方式為稍向內斜刺，針刺角度保持45°，距離5 mm。采用韓式電針儀(設置參數：連續波型，電流為1 mA)導線連接大鼠百會穴、腎俞穴，左右側腎俞穴需要每天交替使用〔6〕。1次/d，7 d為1個療程，連續治療2個療程。2 Hz組電針頻率為2 Hz，50 Hz組電針頻率為50 Hz。模型組和假手術組不做處理。

1.2.3行為學相關指標 采用WMT-100S水迷宮視頻分析系統，進行定位航行實驗：平臺確定在第3象限中間，離水面距離1 cm，大鼠面向池壁從四個象限分別各放入水1次，統計大鼠隱藏到水面以下平臺時間，時間在120 s內，即為逃避潛伏期。空間探索實驗：將平臺去除后，從原平臺象限對側象限將大鼠放入水中，觀察大鼠游泳軌跡，時間在120 s內，記錄大鼠在平臺象限中逗留時間、跨越平臺象限次數。

1.2.4海馬區突觸數目檢測 大鼠斷頭處死后將顱骨快速剝離后，取出大鼠海馬組織大小為1 mm3，放在2.5%的戊二醛固定液中固定保存，制作切片，環氧樹脂包埋，染色后，透射電子顯微鏡下(日立HT7700)統計突觸計數。

1.2.5Western印跡 將采集到的標本10 000 r/min離心10 min，取出上清液，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白定量，將50 μg蛋白加入到2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱處理5 min促使蛋白變性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)完成后進行轉膜，結束后取下硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中4℃下封閉1 h，封閉結束后，加一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋〔突觸素(SYN)、突觸后致密蛋白(PSD)-95、β淀粉樣前體蛋白(APP)、Aβ1～40、Aβ25～35一抗為1∶1 000〕，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次為5 min，加二抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋(1∶10 000)，室溫搖動孵育1 h，最后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次5 min。采用二氨基聯苯胺(DAB)染色試劑盒顯色，光密度掃描后進行定量分析。以GAPDH為內參。

1.2.6NR1、NR2A、NR2B mRNA表達檢測 采用熒光定量檢測NR1、NR2A、NR2B基因表達，將采集到的標本，置于一次性真空無抗凝劑的采血管中，使用聚蔗糖(Ficoll)液分離單個核細胞。Trizol提取細胞RNA，經過電泳檢測RNA并定量，經過逆轉錄合成cDNA。之后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)，探針或SYBR 反應25 μl，反應條件：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40個循環,設置標準組和空白對照。將PCR實驗前3～15個循環熒光信號作為熒光本底信號，調節基線，采用2-△△Ct分析NR1、NR2A、NR2B mRNA基因表達。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1不同頻率電針對大鼠行為學相關指標的影響 與模型組相比，其余3組平均逃避潛伏期、首次跨越平臺時間顯著減少，跨越平臺次數顯著增加(P<0.05)。與假手術組相比，2 Hz組、50 Hz組平均逃避潛伏期、首次跨越平臺時間顯著增加，跨越平臺次數顯著減少(P<0.05)。50 Hz組平均逃避潛伏期、首次跨越平臺時間顯著低于2 Hz組，跨越平臺次數顯著高于2 Hz組(P<0.05)。見表1。

2.2不同頻率電針對大鼠海馬區突觸數目的影響 與模型組相比，其余3組海馬區突觸數目均顯著增加(P<0.05)。與假手術組相比，2 Hz組、50 Hz組海馬區突觸數目均顯著降低(P<0.05)。50 Hz組海馬區突觸數目顯著高于2 Hz組(P<0.05)。見表1。

2.3不同頻率電針對大鼠海馬區SYN、PSD-95表達的影響 與模型組相比，其余3組SYN、PSD-95表達均顯著增加(P<0.05)。與假手術組相比，2 Hz組、50 Hz組SYN、PSD-95表達均顯著降低(P<0.05)。50 Hz組SYN、PSD-95表達顯著高于2 Hz組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組行為學相關指標、海馬區突觸數目、SYN、PSD-95水平比較

2.4不同頻率電針對大鼠海馬區NR1、NR2A、NR2B mRNA的影響 與模型組相比，其余3組NR1、NR2A、NR2B基因表達顯著升高(P<0.05)。與假手術組相比，2 Hz組、50 Hz組NR1、NR2A、NR2B基因表達顯著降低(P<0.05)。50 Hz組NR1、NR2A、NR2B基因表達顯著高于2 Hz組(P<0.05)。見表2。

圖1 Western印跡檢測SYN、PSD-95水平

表2 各組NR1、NR2A、NR2B mRNA影響

2.5不同頻率電針對大鼠海馬區APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白的影響 與模型組相比，其余3組APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白顯著降低(P<0.05)。與假手術組相比，2 Hz組、50 Hz組APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白顯著升高(P<0.05)。50 Hz組APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白顯著低于2 Hz組(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 Western印跡檢測APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白表達

表3 各組APP、Aβ1～40、Aβ25～35蛋白表達比較

3 討 論

AD主要的病理變化是由于Aβ累積引起老年斑發生，細胞內的Tau蛋白因為過度磷酸化導致神經纖維纏結，彌漫性神經元發生變性、缺失，嚴重會造成全腦萎縮〔7,8〕。我國人口老齡化現象越來越明顯，并且隨著患者年齡增加，AD發病率也隨之升高〔9〕。

本研究結果說明50 Hz電針能有效改善大鼠學習記憶障礙，提高大鼠學習記憶能力。與沈曉艷等〔10〕研究結果保持一致。研究指出，AD發病及發展受突觸丟失的影響，突觸損傷是AD最早出現的病理變化，當AD發病時，突觸退行性變快速惡化,主要分布在海馬以及所有的皮質中〔11,12〕。本研究結果說明50 Hz電針對AD大鼠突觸影響效果最明顯。

SYN是一種與突觸可塑性密切相關的蛋白，也是電針治療腦病的重要標志物〔13〕。PSD-95與突觸后可塑性具有相關作用〔14〕。本研究結果提示電針能提高大鼠學習記憶能力，其中50 Hz電針作用效果最強，調控SYN、PSD-95水平上調，有助于突觸結構和功能重塑，起到改善AD學習障礙。NMDAR參與中樞神經系統發育及發展過程，NMDAR主要包括NR1、NR2亞基等類型，對鈣離子具有較高的通透性，其中NR1作為基本亞基是構成離子通道的重要組成，NR2能有效提高NR1對興奮性氨基酸作用〔15,16〕。NMDAR主要存在于海馬區、大腦皮層、下丘腦等，參與中樞神經系統可塑性發育過程。Wang等〔17〕研究指出，NMDAR激動劑在維持、增加學習記憶發揮著重要作用。

APP來源于淀粉樣前體蛋白，正常情況下對細胞無影響，在多種組織中均有表達，尤其是在腦、腎、心肌等組織中表達水平相對較高。Kumar等〔18〕研究指出，APP對神經元可塑性具有一定抗炎作用，在蛋白質裂解酶作用下形成Aβ，從而破壞細胞。APP通過γ酶異常切割，形成Aβ1～40、Aβ25～35蛋白，是淀粉樣斑主要有效成分，會提高毒性，損傷神經元，Aβ沉積是AD發病的主要原因〔19〕。本研究結果提示50 Hz頻率電針對AD模型大鼠干預效果最為顯著，避免Aβ過度累積，降低神經毒性作用。與劉若蘭等〔20〕研究結果保持一致。