基于HPLC檢測老年癡呆患者血清淀粉樣變成分的方法

劉曉丹 呂玉洋 郭夢洋 張丹,2 呂殊星 鄭麗麗 孫續國

(1天津醫科大學醫學檢驗學院，天津 300203；2三河市醫院檢驗科)

老年癡呆(AD)主要病理學特征為大腦皮質和海馬區神經元細胞內外有神經纖維纏結和老年斑塊形成〔1〕。目前臨床診斷AD主要依據影像、臨床評估〔2〕，而AD臨床檢驗項目提出β-淀粉樣蛋白、早老蛋白-1等蛋白為檢測標志物〔3〕，分析這些項目檢測方法的原理，均是基于免疫標記的技術進行測定，檢測的這些AD標志物為淀粉樣變前蛋白，并非沉積于組織內的病理性淀粉樣變成分〔4〕。研究已經證明，病理性淀粉樣變成分與淀粉樣變前蛋白具有相同抗原性，但是分子結構不同。此外，本組先前發現AD血液存在病理性淀粉樣變成分〔5〕，臨床可以直接檢測血液病理淀粉樣變成分的檢測方法。

目前大量研究支持淀粉樣變蛋白聚合后可形成淀粉樣變沉積〔6〕，本文探討用高效液相色譜法(HPLC)分析發生變構的淀粉樣變蛋白和(或)纖維技術，建立一步法定量檢測淀粉樣變成分的方法。

1 資料與方法

1.1研究對象 來自天津醫科大學總醫院、天津醫科大學第二醫院神經內科診治中心確診的AD患者6例，平均年齡(66.80±13.18)歲，健康志愿者6例，平均年齡(69.21±8.94)歲。AD患者均符合美國國立神經病、語言交流障礙和腦卒中研究所-AD及相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)中的AD診斷標準。研究通過大學道德倫理委員會的批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2材料 色譜級乙腈和水購自美國Sigma-Aldrich公司。硫磺素T購自日本東京化成公司。其他化學品購自北京索萊寶有限公司。

1.3方法

1.3.1乙腈沉淀血清蛋白質 將1 ml血清和1 ml乙腈混合并置于冰上1 h，以5 000 r/min離心5 min，分離上清。

1.3.2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 將50 μg血清和上清液用于SDS-PAGE，用考馬斯藍染色，然后使用Quantity One v4.6.6分析。

1.3.3HPLC分離血清蛋白 將100 μl上清注入HPLC系統，該系統由Agilent 1260系列液相色譜儀組成，配備有四元泵和脫氣裝置，恒溫自動進樣器和柱室，多波長檢測器和化學工作站軟件。室溫下在Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱上，通過線性乙腈梯度(50%～86%)洗脫，以1.0 ml/min的流速進行蛋白質的分離，洗脫時間為20 min。

1.3.4硫黃素(Th)T溶液測定淀粉樣變程度 收集保留時間1.5～3.0 min，10.0～14.0 min的上清，使用凍干機(Christ alpha 1-4LD Plus)干燥，然后重懸于50 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液(pH3.0)中，在37℃孵育5 d。取50 μl加入200 μl 2 μmol/L ThT溶液(50 mmol/L Tris，pH7.4)中，使用F-380熒光光譜儀(天津港東有限公司)獲得熒光光譜。ThT熒光發射波長為485 nm，激發波長為450 nm。每份樣本均測定4次。

1.4統計學處理 用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1乙腈沉淀血清中高分子量蛋白 AD患者及健康志愿者乙腈沉淀后上清液蛋白強度低于沉淀前(見圖1)，上清中保留了低分子量蛋白質。

2.2利用HPLC技術分析血清中低分子量蛋白譜系 HPLC保留時間1.1 min AD患者(11.73±1.04)與健康志愿者蛋白譜強度(10.25±1.73)未見明顯差異(P>0.05)，在保留時間1.7 min，健康志愿者色譜峰強度(57.29±2.16)顯著高于AD患者(19.638±1.12，P<0.05)，而在11.3 min，AD患者色譜峰強度(119.31±2.75)顯著高于健康志愿者(44.84±1.84，P<0.05)。

2.3利用ThT測定AD患者血清上清淀粉樣變的熒光強度 保留時間10.0～14.0 min的AD患者血清上清ThT熒光強度顯著高于孵育前(P=0.000 4)，健康志愿者ThT熒光強度孵育前后無統計學差異(P>0.05)。見表1。

圖1 乙腈沉淀血清蛋白前后SDS-PAGE考馬斯亮藍染色

表1 ThT測定血清上清淀粉樣變的熒光強度

3 討 論

目前AD臨床檢驗共識項目是檢測淀粉樣變相關蛋白，而非病理性淀粉樣變纖維成分，建立液體活檢病理性淀粉樣變纖維的方法，將有利于臨床診斷。已經有大量報道，熒光探針ThT能夠特異性與淀粉樣變纖維結合，其熒光強度能夠反映淀粉樣變水平〔7～9〕。另外，最近有研究報道，人血清白蛋白能夠抑制淀粉樣變形成〔10〕，在機體內，這些血清高豐度蛋白干擾利用HPLC分析低豐度蛋白。

據研究報道，乙腈具有良好的降低血清球蛋白及清蛋白電荷特性〔11〕，可以降低血清中球蛋白比例，本實驗結果提示血清中高分子量蛋白得到沉淀，也減少了血清清蛋白及球蛋白的比例。

本研究結果說明AD患者血清中存在病理性淀粉樣變纖維成分；健康志愿者血清中不存在病理性淀粉樣變成分。HPLC對于蛋白成分具有良好的分離效果，結合一定濃度標準品，能夠進行定量分析。

綜上，本研究首次報道利用乙腈沉淀人血清高豐度蛋白，HPLC分離病理性相關淀粉樣變成分的分離條件，該方法為臨床輔助檢驗AD患者血清淀粉樣變纖維成分提供了一種方法。