miR-21和VEGF在結(jié)腸癌中的表達變化及臨床意義

劉艷紅 陳文霞 屈重行 李琨琨 姜媛媛 吳慧麗

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450007)

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率逐年上升，由于腫瘤具有高度侵襲性及轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致治療效果降低及患者預(yù)后不良，因而早期診斷及治療有助于改善患者預(yù)后〔1～3〕。微小RNA(miRNA)在腫瘤中異常表達并可能參與癌癥發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明微小RNA-21(miR-21)在乳腺癌中呈高表達，并可能作為乳腺癌診斷及判斷預(yù)后的重要標(biāo)志物〔4〕。但miR-21在結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制尚未完全闡明。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在結(jié)腸癌中呈高表達并可參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程〔5〕。研究表明miR-21可能通過調(diào)控VEGF表達從而參與膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展〔6〕。但miR-21是否可通過調(diào)控VEGF表達從而參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展尚未可知。本研究主要探討miR-21、VEGF在結(jié)腸癌中的表達并探究其可能臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年5月至2017年2月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院收治的80例結(jié)腸癌患者，年齡45～78歲，平均(63.64±12.03)歲，男43例，女37例，所有患者經(jīng)病理證實為結(jié)腸癌，51例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，29例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；中高分化32例，低分化48例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期患者30例，Ⅲ～Ⅳ期50例。根據(jù)miR-21、VEGF表達量的平均值將結(jié)腸癌患者分為miR-21高表達組(55例)、miR-21低表達組(25例)、VEGF高表達組(50例)、VEGF低表達組(30例)。 納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放化療治療；腫瘤分期符合國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；肝、腎等重要器官嚴重受損；生存期不超過3個月。術(shù)中切除結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)癌旁組織，液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2主要試劑 miR-21、VEGF mRNA引物由廣州Invitrogen公司合成；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.3實時熒光定(qRT)-PCR檢測miR-21、VEGF mRNA的表達水平 采用Trizol法提取結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。miR-21正向引物5′-ATGGGCTGTCTGACAAGCTA-3′，反向引物5′-TCTCGCATAGTACGCTAGCT-3′；VEGF正向引物5′-TCTACCTCCACCATGCCAAG-3′，反向引物5′-CACAGGACG GCTTGAAGATG-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACA GAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，Real-Time Master Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。miR-21以U6為內(nèi)參，VEGF以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-21、VEGF mRNA相對表達量。

1.4隨訪 患者均進行3年隨訪，隨訪方式為電話或復(fù)查，統(tǒng)計患者生存時間及生存率。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析、χ2檢驗；Pearson法、Kaplan-Meier、Log-Rank法、COX比例風(fēng)險回歸。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)腸癌組織中miR-21、VEGF mRNA表達量比較 與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織中miR-21、VEGF mRNA表達量顯著升高(P<0.001)，見表1。

表1 結(jié)腸癌組織中miR-21、VEGF mRNA的表達量比較

2.2miR-21、VEGF表達量與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 miR-21、VEGF與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度密切相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 miR-21、VEGF表達量與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性〔n(%)〕

2.3結(jié)腸癌患者miR-21、VEGF表達量的相關(guān)性 miR-21與VEGF呈正相關(guān)(r=0.619，P=0.000)。

2.4miR-21、VEGF表達量與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性 miR-21低表達組生存率為52.32%，miR-21高表達組生存率為22.10%；VEGF高表達組生存率為18.35%，VEGF低表達組生存率為42.10%，miR-21低表達組與miR-21高表達組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，VEGF高表達組與VEGF低表達組生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-21、VEGF表達量與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性

2.5影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的多因素分析 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、miR-21、VEGF是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討 論

miRNA在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，既往研究顯示miRNA可通過調(diào)控下游靶基因表達從而參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程〔7～9〕。但仍有部分miRNA在結(jié)腸癌發(fā)生過程中的作用機制尚未闡明。

miR-21下調(diào)可抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移及侵襲并可抑制細胞凋亡〔10〕。研究表明miR-21在肺癌患者中表達上調(diào)并可能作為肺癌早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)〔11〕。miR-21在肝癌組織中呈高表達，其高表達量與患者惡性臨床病理特征密切相關(guān)〔12〕。miR-21在大腸癌中呈高表達并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔13〕。本研究結(jié)果說明隨著結(jié)腸癌患者TNM分期的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度的增加miR-21的表達量顯著升高。提示miR-21高表達量可參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程，并在結(jié)腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

VEGF在結(jié)腸癌組織中呈高表達，其表達量與患者臨床病理特征密切相關(guān)〔14，15〕。研究表明VEGF在肺癌中呈高表達，其高表達量與肺癌疾病嚴重程度密切相關(guān)，并可能作為肺癌診斷的有效指標(biāo)〔16，17〕。本研究結(jié)果提示VEGF在結(jié)腸癌中高表達并可能參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程。提示miR-21可能通過促進VEGF表達從而參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程。同時本研究結(jié)果提示miR-21、VEGF表達量升高預(yù)示結(jié)腸癌患者預(yù)后不良，miR-21、VEGF表達量升高可能增加結(jié)腸癌的發(fā)生風(fēng)險并可能作為判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

綜上，miR-21、VEGF在結(jié)腸癌中呈高表達，二者呈正相關(guān)且與患者臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，并可能作為結(jié)腸癌診斷及判斷患者預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。但關(guān)于miR-21、VEGF在結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用機制仍需體內(nèi)實驗與體外細胞實驗進行驗證。