LC-MS/MS法測定人血漿中普蘆卡必利的濃度

李長印，廖健城，陸明霞，宋慧婷，居文政，鄒建東，儲繼紅

(南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇省中醫院，臨床藥理科，江蘇 南京 210029)

琥珀酸普蘆卡必利(prucalopride succinate)為苯并呋喃類促腸動力藥，是特異性的5-HT4受體完全激動劑，對5- HT4受體具有較高的選擇性。它可通過增加膽堿能神經遞質的釋放，刺激腸蠕動反射，增強結腸收縮和近端結腸傳輸，從而有效緩解便秘病人的癥狀[1-2]。琥珀酸普蘆卡必利片由比利時Movetis公司研制，CFDA于2012年12月31日批準了該藥的進口注冊申請，片劑，規格為1 mg、2 mg，商品名為力洛(Resolor)，用于治療成年女性患者中應用輕瀉劑難以充分緩解的慢性便秘癥狀。

前期研究表明，琥珀酸普蘆卡必利片進入人體后主要以普蘆卡必利(prucalopride，PCP)的形式被檢測到[3-7]。近年來，雖然PCP的人體藥代動力學和生物等效性的相關研究已有一些報道[4-6]，對研究中所采用的測定方法如LC-MS/MS法[4, 6]和放射免疫法[5]也有提及，但目前尚無完整系統的人血漿中PCP濃度測定的方法學研究報道。LC-MS/MS法是目前檢測生物樣品中藥物濃度的最常用測定方法[4, 6, 8-9]，Zuo等[3]在PCP大鼠藥代動力學和組織分布的一項研究中考察了大鼠血漿PCP濃度的LC-MS/MS測定方法學，但其中缺乏對溶血、高脂基質效應和全血穩定性等考察項目的驗證。同時，大鼠血樣和人血樣的基質也存在著諸多差異，有可能對PCP的測定產生影響。基于此，本研究旨在建立并驗證一種可靠的PCP人血藥濃度LC-MS/MS測定方法，以滿足PCP人體藥代動力學和生物等效性研究中的檢測需求，為相關藥物制劑的研發提供方法學支持。

1 材料

1.1 藥品與試劑琥珀酸普蘆卡必利對照品(濟川藥業集團有限公司，批號160328，純度99.9%，分子式為C18H26ClN3O3·C4H6O4，結構式見Fig 1A)；PCP-13CD3(dPCP)對照品(內標，美國Stanta Cruz公司，批號E2517，純度99.7%，同位素豐度99.5%，分子式為13CC17H23D3ClN3O3，結構式見Fig 1B)；乙酸銨(ACS公司，HPLC級，批號50Y1408GV)；甲醇(Merck Company，HPLC級)；超純水由Millipore Milli-Q Advantage A10超純水機制備；乙酸乙酯(南京化學試劑股份有限公司，分析純，批號160927513F)；氫氧化鈉(南京化學試劑股份有限公司，分析純，批號11021820130)；琥珀酸普蘆卡必利片(商品名：力洛?，Jassen Clig S.p.A公司，規格2 mg/片)；人空白血漿(江蘇省血液中心)；人空白全血(江蘇省中醫院)；甘油三酯(Sigma-Aldrich，批號SLBZ5252，純度≥99%)；甘油(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號20191226)。

Fig 1 Chemical structures of prucalopride (A) and prucalopride-13CD3 (B)

1.2 實驗儀器液相色譜質聯用儀，包含Pump Agilent 1260 G1312A，Column Oven Agilent 1260 G1316A，Auto Sampler Agilent 1260 G1367E和AB Sciex Mass spectrometer API4000，液質分析檢測系統由軟件AB Sciex Analyst 1.6控制；十萬分之一電子天平(美國Mettler Toledo公司，型號MS105)；萬分之一電子天平(上海菁華公司，型號FA2004N)；常速離心機(常州國華電器有限公司，型號80-4)；高速離心機(德國Eppendorf公司，型號5417R；美國Thermo公司，型號Micro 17R)；微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司，型號WH3)；離心濃縮儀(美國Labconco公司，型號CentriVap)；-80 ℃超低溫保存箱、-20 ℃冷藏冷凍轉換柜、4 ℃醫用冷藏箱均為青島海爾特種電器有限公司生產；移液器(德國Eppendorf公司，規格20 μL/100 μL/200 μL/1000 μL/5000 μL)。

2 方法與結果

2.1 液相色譜與質譜條件液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(3.0×100 mm，3.5 μm)，Agilent ZORAX SB-C18保護柱(4.6×12.5 mm，5 μm)，采用等度洗脫，流動相為含1 mmol·L-1乙酸銨的水：甲醇 (20 ∶80，V/V)，流速400 μL·min-1，柱溫35 ℃，分析時間5 min，進樣體積4 μL。

質譜檢測條件：電噴霧離子源，正離子模式下采用多反應監測(MRM)模式采集數據，PCP的檢測目標離子對為m/z368.4/196.0，去簇電壓(DP)為96 V，碰撞能量(CE)為40 eV，dPCP的檢測目標離子對為m/z374.4/198.0，DP為91 V，CE為43 eV。Dwell Time 200 ms，碰撞室入口電壓(EP)10 V，碰撞室出口電壓(CXP)14 V，碰撞氣(CAD)10 psi，氣簾氣(CUR)25 psi，輔助氣1(GS1)60 psi，輔助氣2(GS2)65 psi，電噴霧電壓(ISV)5 500 V，源溫(TEM)500 ℃。

2.2 標準溶液的配制

2.2.1PCP對照品儲備液及工作液的配制 分別精密稱取琥珀酸PCP對照品10.69 mg和10.41 mg，經質量校正后分別相當于含PCP 8.068 mg和7.856 mg。分別以甲醇溶解、定容至10 mL，搖勻即得濃度為0.806 8 g·L-1的PCP標準曲線儲備液I和濃度為0.785 6 g·L-1的PCP質控儲備液II，將兩者儲存于4 ℃冰箱中備用。

用甲醇將PCP儲備液I進行稀釋，獲得濃度依次為1.179、2.358、4.717、9.434、18.87、37.74、75.47、150.9 μg·L-1的PCP系列標準曲線工作液；用甲醇將儲備液II進行稀釋，獲得濃度依次為1.179、3.275、14.74、117.9 mg·L-1的PCP系列質控工作液。所有工作液4 ℃冰箱中儲存備用。

2.2.2內標dPCP儲備液及工作液的配制 取由Santa Cruz公司精密稱量的dPCP對照品1瓶(1.000 mg)，精密加入1 000 μL甲醇溶解，搖勻，即得1.000 g·L-1的dPCP儲備液；將此儲備液稀釋100 000倍，即得濃度為10 μg·L-1的dPCP工作液。兩者均冷藏于4 ℃冰箱中備用。

2.3 血漿樣品處理

2.3.1空白血樣及受試者含藥血漿樣品的處理 精密吸取空白血漿(或受試者含藥血漿)400 μL于10 mL玻璃管中，依次加入甲醇(或10 μg·L-1的dPCP工作液)100 μL，1 mol·L-1氫氧化鈉溶液80 μL，乙酸乙酯4 mL，渦旋10 min進行充分提取，2 000 r·min×10 min離心，吸取上清液3 mL，于離心濃縮儀中40 ℃揮干，加入80%甲醇水200 μL，渦旋1 min混勻，12 000g×5 min，4 ℃離心，取上清液4 μL進行LC-MS/MS分析。

2.3.2標準曲線血漿樣品的配制與處理 取空白血漿400 μL于10 mL玻璃管中，分別依次精密加入系列標準曲線工作液20 μL，渦旋混勻，即得濃度依次為0.058 96、0.117 9、0.235 8、0.471 7、0.943 4、1.887、3.774、7.547 μg·L-1的系列PCP標準曲線血漿樣品。后續處理同“2.3.1”項。

2.3.3質控血樣的配制與處理 分別取空白血漿400 μL于10 mL玻璃管中，分別精密加入系列質控工作液20 μL，渦旋混勻，即得濃度依次為0.058 96、0.163 8、0.737、5.896 μg·L-1的系列PCP質控血樣。后續處理同“2.3.1”項。

2.4 分析方法的驗證

2.4.1方法的選擇性 如Fig 2A所示，在該方法設定的LC-MS/MS分離檢測條件下，溶液及血漿樣品中PCP和dPCP的色譜峰形良好，出峰時間穩定在3.6 min左右；如Fig 2B所示，不含內標的定量上限樣本中待測物在內標檢測離子通道無明顯干擾；如Fig 2C所示，工作液濃度的內標dPCP在待測物PCP檢測離子通道無明顯干擾；如Fig 2D-F所示，空白血漿、含藥血漿及待測血漿樣品中PCP和dPCP檢測離子通道均無明顯干擾峰出現。上述考察結果表明，該方法特異性良好，血漿基質中的內源性化合物和代謝物不影響PCP的準確定量，待測物和內標間無影響檢測的相互干擾。此外，在標準曲線的定量上限樣品之后進樣分析的雙空白血漿樣品中未見明顯的PCP和dPCP干擾峰，表明該方法無明顯系統殘留。

Fig 2 Typical LC-MS/MS chromatograms of prucalopride (PCP) and prucalopride-13CD3 (dPCP)

2.4.2基質效應 按“2.3.1”項處理6份不同來源的正常空白血漿、1份溶血基質空白血漿(由空白血漿加入4%空白全血混合配制而成)、1份高脂基質空白血漿(稱取甘油三酯30.63 mg溶解在0.2 mL甘油中，再加入空白血漿9.80 mL，混勻即得)，獲得其相應的吹干樣品，用于配制未經提取的含藥基質樣品。分別向其中加入20 μL的低、高濃度PCP質控工作液，再依次加入dPCP工作液100 μL、50%甲醇水溶液80 μL，渦旋1 min混勻，12 000g×5 min，4 ℃離心，吸取上清液4 μL進行LC-MS/MS 分析。每個濃度平行制備6個樣品。記錄色譜圖、PCP色譜峰面積As和dPCP色譜峰面積Ai。

2.4.3標準曲線與線性范圍 按照“2.3.2 ”項制備并檢測標準曲線血漿樣品，記錄色譜圖、PCP色譜峰面積As和dPCP色譜峰面積Ai。以PCP血藥濃度C為X軸，以As與Ai的比值f(f=As/Ai)為Y軸，以1/C2作為權重系數，進行線性回歸。最終標線方程為y=(1.22±0.04)x+(0.0285±0.003 98)(n=5)，相關系數r為0.996 3～0.999 6。由上述結果可知，在0.058 96～7.547 μg·L-1的血藥濃度范圍內，PCP色譜峰面積比值與其濃度的線性關系良好。

2.4.4精密度和準確度考察 按“2.3.3”項制備并檢測PCP系列質控血樣，每個濃度平行6個樣品，連續制備并檢測3批。記錄色譜圖、PCP色譜峰面積As和dPCP色譜峰面積Ai。計算峰面積比值f(f=As/Ai)，進而將f值代入隨行標線方程，求得各質控血樣的實測濃度及其準確度。批內精密度以第一批質控血樣(n=6)的實測濃度值的CV表示，批間精密度用所有3批質控血樣(n=18)的實測濃度值的CV表示。Tab 1匯總了精密度和準確度考察的詳細測定結果。結果表明，本方法的批內及批間準確度良好，且精密可重現。

2.4.6穩定性考察

2.4.6.1 待測物儲備液穩定性 精密吸取按“2.2”項新鮮配制的PCP儲備液a和dPCP儲備液、已于室溫避光放置6 h后的PCP儲備液b、已于4 ℃冰箱中放置59 d的儲備液c適量，分別用甲醇將3種PCP儲備液稀釋至3.019 μg·L-1，將dPCP儲備液稀釋至10 μg·L-1，而后將3種PCP稀釋液分別和dPCP稀釋液等體積混合均勻后進樣分析，每種PCP儲備液平行配制6個樣品。記錄色譜圖、化合物色譜峰面積。考察新鮮配制儲備液與放置后PCP儲備液的峰面積偏差和CV(n=6)，峰面積偏差=(放置的儲備液峰面積均值-新鮮配制的儲備液峰面積均值)/新鮮配制的儲備液峰面積均值。結果顯示：與新鮮配制的PCP儲備液相比，放置6 h和59 d后PCP儲備液的峰面積偏差分別為3.11%和-5.33%，CV分別為1.93 %和2.51%。結果表明，待測物PCP儲備液室溫避光放置6 h及4 ℃冰箱中放置59 d均穩定。

2.4.6.2 待測物和內標工作液穩定性 精密吸取按“2.2”項新鮮配制的濃度分別為1.179和150.9 μg·L-1的PCP工作液各20 μL，依次加入新鮮配制的濃度為10 μg·L-1的dPCP工作液 100 μL及甲醇80 μL，混合均勻后，作為新鮮配制的工作液穩定性考察用樣品，進行LC-MS/MS分析，平行配制6份。同法制備分析室溫避光放置6 h的工作液穩定性樣品，以及4 ℃冰箱中放置12 d的工作液穩定性樣品。記錄色譜圖、化合物色譜峰面積。計算工作液放置后與新鮮配制時的色譜峰面積偏差及其CV(n=6)，其中峰面積偏差=(放置后工作液峰面積均值-新鮮配制工作液峰面積均值)/新鮮配制工作液峰面積均值。測定結果顯示：與新鮮配制時相比，濃度為1.179和150.9 μg·L-1的PCP工作液放置6 h后，其色譜峰面積偏差分別為0.56%和1.32%，CV分別為2.97%和1.48%；放置12 d后其峰面積偏差分別為2.36%和-1.10%，CV分別為4.35%和3.24%；濃度為10 μg·L-1的dPCP工作液放置6 h后的峰面積偏差為4.04%，CV為3.87%。上述考察結果表明，待測物PCP工作液室溫避光放置6 h及4 ℃冰箱中放置12 d均穩定，內標dPCP工作液室溫避光放置6 h穩定。

2.4.6.3 血漿樣品穩定性 按“2.3.3”項制備低、高濃度PCP質控血樣，分別考察室溫放置6 h、-80 ℃反復凍融3次、-80 ℃凍存56 d、-20 ℃凍存60 h的血漿樣本穩定性，以及處理后樣品于自動進樣器(8 ℃)中放置24 h的穩定性。每個存放條件下每個濃度平行6個樣品。結果見Tab 2，表明血漿樣品在上述各種存放條件下的穩定性良好。

Tab 1 Intra- and inter-batch precision and accuracy for determination of PCP in human plasma

2.4.6.4 全血樣品穩定性 分別精密吸取濃度為3.275、117.9 μg·L-1的質控工作液50 μL于1 000 μL空白全血中，混勻即得濃度0.163 8、5.896 μg·L-1的低、高濃度全血樣品。每個濃度平行6個樣品為1組，共制備2組。1組立即離心，取上層血漿400 μL，按“2.3.3”項進行樣品制備并檢測；另一組室溫放置4 h后離心，取上層血漿400 μL同法制備樣品并檢測。記錄色譜圖、PCP色譜峰面積As和dPCP色譜峰面積Ai，計算色譜峰面積比值f(f=As/Ai)，將f值代入隨行標線方程求得各樣品實測濃度及其準確度，并計算CV(n=6)。測定結果顯示：低濃度全血樣品0 h和4 h實測濃度分別為(0.170 0±0.006 619)和(0.157 7±0.008 632)μg·L-1，準確度均值分別為103.8%和96.30%，CV分別為3.89%和5.47%；高濃度全血樣品0 h和4 h實測濃度分別為(5.843±0.087 69)和(5.328±0.423 3)μg·L-1，準確度均值分別為99.10%和90.36%，CV分別為1.50%和7.95%。結果表明，PCP在全血樣品基質中室溫放置4 h穩定性良好。

2.5 應用女性健康受試者24名，經體檢合格后，簽署知情同意書，并通過南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審批，進行人體藥代動力學試驗。各受試者口服琥珀酸普蘆卡必利片1片，分別于給藥前、給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、48和72 h經肘靜脈取血4 mL置于檸檬酸鈉化的采血管中，混和均勻，4 ℃離心，3 000 r·min-110 min，吸取上層血漿，按“2.3.1”項制備血樣，并進行LC-MS/MS分析，檢測受試者血樣中的PCP藥物濃度。濃度測定結果顯示，服藥后各受試者的PCP血藥濃度在0.075 9～5.455 μg·L-1之間，均處于本方法的線性范圍(0.058 96～7.547 μg·L-1)內。該試驗結果表明，本研究所建立并驗證的LC-MS/MS分析方法適用于檢測人血漿中PCP藥物濃度，可滿足PCP人體藥代動力學和生物等效性研究的需要。

3 討論

在方法學建立和優化過程中，作者對不同的色譜柱類型、流動相組成、樣品前處理方法和質譜檢測條件等進行了多種嘗試。結果表明：① Agilent ZORBAX SB C18色譜柱的色譜峰形和分離效果優于Alltima HP C18、Chrom-matrix innovationTMUltimate C18和Agilent Poroshell 120 SB-C18等色譜柱。② 在水相流動相中加入終濃度為1 mmol·L-1的乙酸銨，可使PCP及dPCP的保留時間穩定，具有良好的色譜峰峰形和響應；流動相中如果加入甲酸會導致保留時間明顯前移，加入氨水會使其后移，加入甲酸銨則會使保留時間不穩定，三者間的各種組合及其與乙酸銨的組合均沒有單用1 mmol·L-1乙酸銨好。③蛋白沉淀法不能滿足當前儀器的靈敏度要求；乙酸乙酯提取回收率優于乙醚和二氯甲烷，提取過程中加入NaOH溶液可提高乙酸乙酯提取效率，最佳加入濃度和量分別為1 mol·L-1和80 μL。④由于PCP結構中含有氯元素(Fig 1)，其同位素離子也具有較高的豐度，導致PCP可能對同位素內標產生干擾，因此作者選用內標dPCP的同位素離子[M+2+H]+作為內標監測離子對的母離子，從而避免了分析物對內標產生的干擾。

本研究首次建立了基于乙酸乙酯液液萃取的人血漿中PCP濃度的LC-MS/MS測定方法，并對該方法的選擇性、基質效應(包括溶血和高脂)、線性、精密度和準確度、提取回收率、穩定性(包括全血穩定性)等進行了系統驗證，結果表明：該方法簡單、可靠、靈敏、穩定、耐用。與文獻報道的PCP血漿濃度的LC-MS/MS測定方法相比，本方法的優勢在于：① 與前期研究多采用蛋白沉淀法處理樣品相比[3-4]，本方法采用乙酸乙酯萃取所得進樣樣品更為“干凈”，更適用于臨床研究的高通量樣品分析；同時借此可對待測物PCP進行一定程度的濃度富集，對儀器本身的靈敏度要求不高，使得方法更具有普遍適用性。② 通過對流動相、樣品前處理方法等多環節的摸索優化，方法的靈敏度有所提高(從0.1 μg·L-1～0.058 96 μg·L-1)[3, 5]。③ 與前期研究不同，采用同位素內標dPCP有助于消除基質效應，使得該方法更耐用；同時采用內標的同位素離子作為監測離子可避免PCP對內標檢測的干擾，使得該方法更可靠。上述優勢保證該方法能夠準確快速地測定人血漿中PCP藥物濃度，適用于PCP相關制劑的人體藥代動力學和生物等效性研究。