鐵死亡誘導劑Erastin促進紫草素誘導的結直腸癌細胞凋亡的作用

張 梅，何旨意，黃慶洋，張阿潔，覃彥蓉，劉 揚，鄭海倫

(1. 蚌埠醫學院第一附屬醫院，2. 蚌埠醫學院藥學院/安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽 蚌埠 233030；3. 廣州歡網科技有限責任公司，北京 100021)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種發病率高、死亡率高的常見惡性腫瘤，是全球最緊迫的健康問題之一。根據GLOBOCAN 2020年全球發病率和死亡率估計報告，大腸癌是全球第三大確診癌癥和第二大癌癥相關死亡原因[1]。目前治療結直腸癌的方法包括手術、放療、化療、免疫治療和生物靶向治療[2]。然而，大多數癌癥患者最終還是會復發并產生抗藥性[3]。因此，迫切需要尋找既能提高抗癌藥物的藥效，又能克服多藥耐藥和毒副作用的有效化療增敏劑。

紫草素(shikonin,Shi)是從紫草根中提取的一種化合物[4]。研究表明，Shi已在多種人類癌癥中顯示出抗腫瘤活性，例如神經膠質瘤[5]、黑色素瘤[6]、乳腺癌[7]、肝細胞癌[8]等。研究發現[9]，Erastin(Era)對結直腸癌細胞具有明顯的細胞毒作用，進一步研究發現，Era減輕了結直腸癌細胞對化療藥物的耐藥性。最近，聯合化療被發現是一種更好的治療策略[10]，既能提高抗癌藥物的療效，又能克服多藥耐藥并減輕毒副作用。Shi單獨或與其他藥物聯合使用導致細胞死亡的機制，需要進一步研究。本研究主要探討鐵死亡誘導劑Era與Shi聯合應用對結直腸癌細胞SW480和SW620抗腫瘤活性的影響并分析其可能作用機制，以期為結直腸癌的治療提供一種很有前途的策略。

1 材料與方法

1.1 材料人結直腸癌細胞株SW480(CL-0223)、SW620(CL-0225)購于武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM高糖培養基(C11995500BT)購于Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(FSP500)購于ExCell Bio。紫草素(HY-N0822)和Erastin(HY-15763)均購自MCE公司。胰酶細胞消化液(BL501A)購于biosharp，CCK-8(K1018)、Annexin-V /PI雙染試劑盒(BB-4103-100T)購于貝博公司；乳酸檢測試劑盒(A019-2-1)購自南京建成；Bax(50599-2-Ig)、Bcl-2(12789-1-AP)、PARP1(13371-1-AP)、caspase 3(19677-1-AP)、caspase 8(13423-1-AP)、AKT(10176-2-AP)、山羊抗兔IgG(SA00001-2)和β-actin(66009-1-Ig)均購自Proteintech，p-AKT(4060S)購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人結直腸癌細胞SW480，SW620培養于含10%熱滅活胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素高糖DMEM培養基中，在37 ℃、含5% CO2的加濕、恒溫培養箱中常規培養。

1.2.2CCK-8檢測細胞存活率 將對數生長期的SW480、SW620細胞接種于96孔板，8×103/孔，放置于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養，2 h后棄去孔中培養液，加入含有不同濃度(0、10、20、40、80、100 μmol·L-1)Era和(SW480:0、1、2、4、8、16 μmol·L-1；SW620:0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1)Shi的DMEM培養液，并設置空白組，每組3個復孔。之后置于培養箱，分別培養24 h和48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續孵育2 h，用酶標儀于450 nm處檢測吸光度，實驗重復3次。根據藥物劑量效應曲線分別計算出Era和Shi的半數抑制濃度(IC50)。再選用濃度低于IC50的Era與不同濃度(SW480:0、1、2、4、8、16 μmol·L-1；SW620:0,0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1)的Shi聯合作用于SW480和SW620細胞24 h，觀察單用Shi以及Shi與Era聯合應用對SW480、SW620細胞活力的影響。

1.2.3Erastin與紫草素的結合指數CI 根據CCK-8檢測結果使用CompuSyn軟件計算結合指數CI。CI=1表示兩藥起到相加作用；CI<1表示協同作用；CI>1表示拮抗作用。Era濃度為10 μmol·L-1，Shi濃度梯度分別為1、2、4和0.5、1、2 μmol·L-1作用于SW480和SW620。

1.2.4倒置顯微鏡觀察細胞形態變化 將人結直腸癌細胞SW480和SW620接種于6孔板，2×105/孔，置于37 ℃，5% CO2培養箱中常規培養，24 h后棄去孔中培養液，細胞分為4組，含DMEM培養液的對照組，10 μmol·L-1Era組，2 μmol·L-1Shi(SW480)組(SW620：1 μmol·L-1Shi)以及兩者聯合用藥組，繼續培養24 h后使用倒置顯微鏡拍照。

1.2.5活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成量的測定 收集對數生長期的SW480、SW620細胞，按3×105/孔種于6孔板中，SW480細胞組加入濃度分別為0、10 μmol·L-1Era、2 μmol·L-1Shi以及兩者合用組；SW620細胞組加入濃度分別為0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1Shi以及兩者合用組。置于培養箱中24 h，棄去培養基，PBS清洗，將10 μmol·L-1的DCFH-DA以500 μL/孔加入6孔板中，放37 ℃培養箱中染色30 min，棄去染液，收集細胞，用流式細胞儀檢測活細胞內ROS的生成量。

1.2.6培養液中乳酸含量的測定 對數生長期的SW480、SW620細胞，3×105/孔種于6孔板中，SW480細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、2 μmol·L-1Shi以及兩者合用組；SW620細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1shi以及兩者合用組。置于培養箱中24 h，收集培養液，按照乳酸檢測試劑盒說明書進行乳酸含量的測定。實驗重復3次。

1.2.7AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI雙染檢測細胞凋亡 將對數生長期的SW480、SW620細胞，按3×105/孔種于6孔板中，SW480細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、2 μmol·L-1Shi以及兩者合用組；SW620細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1Shi以及兩者合用組。置于培養箱中24 h，收集培養液，PBS清洗，收集細胞。于冰上避光加入5 μL AnnexinV/PI染色15 min；然后加入10 μL PI染液，染色5 min。上機，用流式細胞儀檢測藥物對細胞凋亡的影響。實驗重復3次。

1.2.8Western blot檢測Bax、Bcl-2、PARP1、caspase3、caspase8、AKT和p-AKT的表達 結直腸癌細胞SW620接種于60 mm平皿而后置于培養箱培養48 h后，棄去培養液，更換為含有0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1shi以及兩者合用組的DMEM培養液，置于培養箱中24 h，加入100 μL含有PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-14 ℃離心30 min。取上清，BCA蛋白定量法計算出每組所需上樣量。每組取60 μg蛋白進行電泳，之后蛋白轉移至PVDF膜，洗膜1次，5 min。封閉30 min，洗膜3次，每次5 min。4 ℃敷一抗過夜。洗膜3次，每次5 min。室溫搖床敷二抗1 h，洗膜3次，每次5 min。ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統采集圖像。

2 結果

2.1 Erastin與Shikonin單用及聯合應用對結直腸癌細胞增殖的影響人結直腸癌細胞SW480、SW620經藥物作用并計算出IC50(24 h)：SW480-Shi為1.98 μmol·L-1，SW480-Era為35.83 μmol·L-1，SW620-Shi為1.204 μmol·L-1，SW620-Era為22.24 μmol·L-1。Era和Shi聯合應用對結直腸癌細胞的增殖抑制作用明顯高于單用藥組(Fig 1)。使用10 μmol·L-1Era分別與不同濃度Shi(SW480：1、2、4 μmol·L-1；SW620：0.5、1、2 μmol·L-1)聯合應用24 h，經CompuSyn軟件計算出CI值(Tab 1)，結果表明聯合用藥具有協同作用。

Fig 1 Combination of Erastin and Shikonin exhibits synergistic anticancer effects

Tab 1 Combination index (CI) of Erastin and Shikonin on SW480 or SW620

2.2 Erastin、紫草素單用及聯合用藥對SW480與SW620細胞形態學的影響如Fig 2所示，10 μmol·L-1Era處理組細胞形態和密度與對照組相比無明顯差別，2 μmol·L-1和1 μmol·L-1Shi處理組細胞密度減少，而聯合用藥組細胞形態與密度則有明顯的改變。

Fig 2 The morphological changes of colorectal cancer cellsA E:control. B F:Era. C G:Shi. D H:Era+Shi.

2.3 Erastin、shikonin單用及聯合用藥對SW480與SW620乳酸水平的影響如Fig 3所示，聯合用藥組中糖酵解的最終產物乳酸的產生比單用Shi組抑制作用更明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)。

Fig 3 Changes of lactate level**P<0.01 vs Shi-2(Shi-1) .

2.4 Erastin、紫草素單用或聯合用藥對結直腸癌細胞活性氧含量的影響如Fig 4所示，ROS檢測結果表明，單獨處理組ROS產生不明顯，聯合用藥組ROS水平比Shi組明顯升高(Fig 4A，B)。

Fig 4 Changes of ROS levelA and B: Intracellular ROS generation were measured (E:Erastin,S:Shikonin).

2.5 Erastin、紫草素單用或聯合用藥對結直腸癌細胞凋亡的影響如Fig 5所示，為了進一步闡明聯合作用抑制細胞生長的機制，我們用Annexin V/PI染色法檢測了Shi和/或Era對結直腸癌細胞的促凋亡作用。如Fig 5A，B所示，與單獨使用Era或Shi相比，聯合治療導致凋亡細胞比例明顯增加。凋亡檢測結果表明，聯合用藥組與Shi組相比差異有統計學意義(Fig 5C，D)。

Fig 5 Erastin enhances shikonin-induced cell apoptosis

2.6 聯合用藥對結直腸癌細胞SW620相關蛋白的影響Fig 6A顯示，10 μmol·L-1Era和1 μmol·L-1Shi兩者合用組p-Akt明顯低于單用Shi組。如Fig 6B顯示，單用藥組Bcl-2和Bax的表達沒有明顯變化，聯合用藥組可顯著抑制Bcl-2的表達，上調Bax的表達。與流式細胞儀結果一致，Era處理明顯增強Shi誘導的caspase 3和caspase 8的激活，進而Cleaved-caspase 3，Cleaved-caspase 8和Cleaved-parp1表達增加。PARP是caspase的底物，裂解的PARP被認為是細胞凋亡的重要標志。此研究結果表明鐵死亡誘導劑Era與Shi聯合應用可以促進凋亡相關蛋白的激活。

Fig 6 The expression levels of related proteins in SW620 cells

3 討論

Shi是從中國草本植物紫草中分離出來的一種天然化合物，幾千年來一直被用來治療各種疾病[11]。Shi通過誘導細胞內氧化應激抑制惡性腫瘤細胞生長和誘導癌細胞凋亡[12]。研究表明[13]，紫草提取物具有多種藥理活性，包括抗炎、抗氧化應激、抗病毒、抗菌和抗癌。研究發現[14]，Erastin和順鉑的聯合應用具有協同作用，表明在結直腸癌中鐵死亡增加了經典治療藥物和抗腫瘤機制所觸發的另一種細胞死亡途徑。在本研究中，Erastin和Shi聯合用藥的結果顯示，Erastin能有效地增強Shi誘導的細胞凋亡，并顯示出協同抑制結直腸癌細胞增殖的作用。也有研究表明[15]，Erastin可能通過誘導氧化應激對結直腸癌細胞產生細胞毒性和促凋亡作用。

在腫瘤細胞中，Shi治療通過抑制丙酮酸激酶M2(PKM2)的活性來抑制糖酵解，通過增加ROS的產生來誘導細胞凋亡[16]。我們的研究結果表明，聯合用藥組ROS含量明顯高于Shi組。癌細胞中ROS的增加在癌癥的發生和發展中起著至關重要的作用。本實驗乳酸含量檢測結果顯示，合用組能顯著抑制乳酸的產生。腫瘤細胞以高速率產生乳酸，乳酸是一種經常被忽視的碳源，但可以促進三羧酸循環(TCA)回補；循環乳酸也是調節氧化還原平衡的重要手段[17]。Akt信號通路在細胞中發揮重要作用，介導多種細胞機制，如增殖、存活、血管生成、自噬和凋亡。據報道，Akt級聯信號通路有助于腫瘤細胞的發生、增殖、侵襲和發展。因此，Akt級聯抑制可以避免腫瘤的發生。在本研究中，Erastin和Shi聯合治療可顯著降低Bcl-2的表達，而增加Bax的表達。Bcl-2家族最終表達失衡導致結直腸癌細胞凋亡。

綜上所述，Erastin作為Shi的增效劑，可能通過誘導細胞內氧化應激、抑制乳酸產生、抑制Akt通路，進而使促凋亡蛋白高表達，抗凋亡蛋白低表達來實現協同抗癌作用的一種高效途徑。此研究結果證明ROS的產生可能是開發新的抗癌藥物的一個很好的策略，因此，Erastin可能是一種很有前途的化療增敏劑，可以作為以Shi為基礎的癌癥治療藥物，也可作為一種新型的抗結直腸癌藥物，應在腸道疾病領域內進一步研究。