育齡女性FMR-1 基因CGG 重復(fù)序列的研究

張和江，田海清

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，新疆 烏魯木齊 830000；2.烏魯木齊市開發(fā)區(qū)興豐社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站，新疆 烏魯木齊 830000）

脆性X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是人群中遺傳因素引起的最常見的智力殘疾（intellectual disability，ID）[1]，是脆性X 智力低下1（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR-1）基因中CGG 重復(fù)序列次數(shù)的擴增所致。FMR-1 基因在不同種族和地域差異較大[2]。我國是出生缺陷高發(fā)國家，大部分的出生缺陷是由環(huán)境與遺傳因素交互作用引起的，約占出生缺陷總發(fā)生率的65%左右[3]。本研究從基因水平探究新疆少數(shù)民族與漢族正常育齡人群及反復(fù)生育失敗和早發(fā)性卵巢功能不全患者中FMR-1 基因的分布及差異情況，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019 年8 月1 日-2020 年6 月30 日在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心主動要求行FMR-1 基因檢測及有不明原因反復(fù)生育失敗或早發(fā)性卵巢功能不全的育齡女性進行研究，排除家族中有脆性X 綜合征先證者和數(shù)據(jù)缺失者。最終納入351 例育齡女性，根據(jù)民族分為A 組（漢族）279 例和B 組（少數(shù)民族）72 例。A 組中正常育齡女性205 例，反復(fù)妊娠失敗及早發(fā)性卵巢功能不全女性74 例；B 組中正常育齡女性45 例，反復(fù)妊娠失敗及早發(fā)性卵巢功能不全女性27 例。兩組年齡、BMI、身高、體重、孕次、產(chǎn)次比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究是一項單中心的回顧性觀察研究，研究方案獲得了醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者知情同意，并簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較（）

表1 兩組一般資料比較（）

1.2 方法 每位受試者取2 ml 靜脈全血，凍存統(tǒng)一快遞送至北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科進行DNA 提取，使用QIAamp 全血DNA 提取試劑盒（Qiagen，德國），實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。同一個體中FMR-1 的兩個等位基因（CGG）重復(fù)次數(shù)[4]相對少者定義為allele-1，相對多者定義為allele-2。按照國際慣例[5]取allele-2 的重復(fù)數(shù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件包SPSS 20.0 版進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CGG 重復(fù)序列分布情況 351 例育齡女性中共發(fā)現(xiàn)20 種不同的CGG 重復(fù)數(shù)，最小24 次，最大49 次。兩組最常見的CGG 重復(fù)次數(shù)均是30 次，其中A 組73 例，占26.16%；B 組26 例，占36.11%；第2 個常見的CGG 重復(fù)次數(shù)是29 次，A 組72 例，占25.81%，B 組17 例，占23.61%；第3 個常見的CGG 重復(fù)次數(shù)是31 次，A 組42 例，占15.05%，B 組3 例，占4.17%。兩組除具有30 次和29 次高峰外，還有第2 個高峰，即CGG 重復(fù)次數(shù)36 次（A 組27例，占9.68%；B 組6 例，占8.33%）及37 次（A 組19例，占6.81%；B 組4 例，占5.56%）。CGG 重復(fù)序列分布情況見圖1、圖2。

圖1 A 組CGG 重復(fù)序列分布情況

圖2 B 組CGG 重復(fù)序列分布情況

2.2 兩組灰區(qū)分布情況 351 例育齡女性中發(fā)現(xiàn)2 例CGG 重復(fù)序列灰區(qū)，未發(fā)現(xiàn)前突變及全突變病例。2例灰區(qū)均在A 組（CGG 重復(fù)序列為45 次和49 次），發(fā)生率為0.72%，其中正常育齡女性灰區(qū)發(fā)生率為0.49%，反復(fù)妊娠失敗及早發(fā)性卵巢功能不全育齡女性灰區(qū)發(fā)生率為1.35%，見表2、表3。

表2 兩組正常育齡女性灰區(qū)分布比較[n（%）]

表3 兩組反復(fù)妊娠失敗及早發(fā)性卵巢功能不全患者灰區(qū)分布比較[n(%)]

3 討論

FMR-1 基因因?qū)е乱环N常見的遺傳性疾病即脆性X 綜合征而受到重視。脆性X 綜合征是目前世界范圍內(nèi)位于唐氏綜合征之后最常見的遺傳性智力障礙的疾病。FMR-1 基因位于性染色體X 的末端Xq23，其啟動子區(qū)出現(xiàn)以CGG 為單位的動態(tài)三聯(lián)重復(fù)。該CGG 重復(fù)序列在正常個體中存在長度的變化，攜帶者和患者中會顯著增加[6]。根據(jù)不同的擴增數(shù)量，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）將CGG 重復(fù)序列分為4 大類[7]：CGG 重復(fù)數(shù)在5～44 次定義為“正常型”；45～54 次為中間型或者灰區(qū)；55～199 次為前突變；200 次以上為全突變。全突變的臨床表型即為脆性X 綜合征，在臨床上有典型的遺傳性智力低下或自閉癥等表現(xiàn)。該病目前沒有根治的方法，為了提高出生人口素質(zhì)，減少患兒的出生，預(yù)防脆性X 染色體綜合征具有重要臨床意義。

FMR-1 基因序列在不同種族和地域差異較大，全突變和前突變個體的發(fā)病率由于評估的地理區(qū)域和人群的不同而不同，西方人群的研究結(jié)果不一定適用于我國人群。我國關(guān)于FMR-1 基因的研究起于1986 年的家系報道，2015 年Huang W 等[8]報道了我國的第1 個較大人群的FMR-1 基因篩查結(jié)果。但目前我國關(guān)于FMR-1 基因的研究較少，而關(guān)于FMR-1基因在我國少數(shù)民族人群的篩查資料更少。

3.1 FMR-1 基因CGG 重復(fù)數(shù)在新疆少數(shù)民族及漢族人群中的分布 本研究351 例（漢族279 例，少數(shù)民族72 例）育齡女性進行FMR-1 等位基因CGG 重復(fù)序列的篩查，結(jié)果顯示CGG 重復(fù)次數(shù)最多的是30 次，尤其是少數(shù)民族（少數(shù)民族占36.11%，漢族占26.16%）；其次為29 次CGG 重復(fù)（漢族占25.81%，少數(shù)民族占23.61%），兩組間無明顯差異。與多個研究相同的是，CGG 重復(fù)次數(shù)29 次和30 次在各民族中最常見[9-11]；但Essop FB 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在黑人和白人群體中其分布有顯著差異，CGG 重復(fù)30 次是白人群體中最常見的等位基因，占34%；黑人和混血兒群體中最常見的等位基因為CGG 重復(fù)29 次（占總體的41%）。此外，本研究中漢族人群中第2 個最常見的CGG 重復(fù)次數(shù)是31 次（占15.05%），但在少數(shù)民族中數(shù)量較少，僅占4.17%。大多數(shù)來自西方人群的研究顯示[12，13]，30 和29 最常見的CGG 重復(fù)數(shù)，呈“單峰”聚集。本研究漢族和少數(shù)民族也均顯示此峰，但除此峰外，在漢族及少數(shù)民族中均還有另一亞峰，即CGG 重復(fù)次數(shù)36（漢族占9.7%，少數(shù)民族占8.3%）及37（漢族占6.8%；少數(shù)民族占5.6%）。

3.2 漢族和少數(shù)民族正常育齡女性FMR-1 灰區(qū)的發(fā)生率 FMR-1 基因前突變發(fā)生率在不同種族和地域差異較大[14]。Gao F 等[15]對我國的10 145 名育齡婦女的FXS 篩查結(jié)果顯示，我國女性中中間攜帶者和前突變攜帶者的患病率分別為1/130 和1/634。本研究對新疆351 例漢族及少數(shù)民族育齡女性進行篩查，未發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)前突變和全突變病例。漢族279 例發(fā)現(xiàn)2 例灰區(qū)（CGG 重復(fù)序列為45 和49 次），發(fā)生率0.72%，少數(shù)民族共72 例未發(fā)現(xiàn)灰區(qū)。有研究表明[16]，脆性X 綜合征中間重復(fù)范圍攜帶者的頻率為1∶137（1∶172～1∶110）。因此，本研究中新疆漢族及少數(shù)民族人群中前突變及灰區(qū)并不高，與劉帆等[17]報道得出灰色區(qū)域等位基因的發(fā)病率明顯高于亞洲及國內(nèi)發(fā)病率不同，其漢族育齡女性共98 例檢出FMR-1 基因的突變灰色區(qū)域患者1 例，攜帶率為1∶98，考慮其樣本量小所致。

3.3 漢族和少數(shù)民族反復(fù)妊娠失敗和早發(fā)性卵巢功能不全患者FMR-1 灰區(qū)的發(fā)生率 研究發(fā)現(xiàn)[18]，F(xiàn)MR-1 基因與人類生殖細胞的增殖有關(guān)，胎兒的卵巢及成年女性卵泡的顆粒細胞上都有FMR-1 基因的表達。由于CGG 重復(fù)序列可能以某種方式干擾了胎兒卵巢FMR-1 基因的轉(zhuǎn)錄，引起該突變基因的攜帶者在出生時即存在卵母細胞數(shù)量和質(zhì)量的下降，其卵巢功能的臨床表型具有高度的異質(zhì)性[19，20]，可發(fā)生脆性X 相關(guān)的卵巢儲備能力下降，表現(xiàn)為不明原因的不孕、生育力下降、反復(fù)不明原因流產(chǎn)或IVF 失敗等。另有研究顯示[10]，女性前突變攜帶者發(fā)生脆性X 綜合癥的可能性較小，但發(fā)生原發(fā)性卵巢功能不全的風(fēng)險高達21%。目前認為FMR-1 是導(dǎo)致卵巢儲備功能下降甚至卵巢早衰的重要突變基因之一[21]。而灰區(qū)主要指在遺傳中基因表達的CGG 重復(fù)序列缺乏穩(wěn)定性的類型，有研究發(fā)現(xiàn)[22]，灰區(qū)與正常核型的患者比較，前者的預(yù)期絕經(jīng)年齡早（約7 年），不孕癥及月經(jīng)周期異常的發(fā)生率高，卵巢早衰發(fā)生率高，且非整倍體妊娠流產(chǎn)的發(fā)生率高。

本研究發(fā)現(xiàn)本地區(qū)漢族育齡女性中反復(fù)妊娠失敗及早發(fā)性卵巢功能不全患者灰區(qū)發(fā)生率為1.35%，其發(fā)生率高于正常女性的0.49%，與陳蔚琳等[14]研究結(jié)果類似。此外，少數(shù)民族育齡女性均未發(fā)現(xiàn)灰區(qū)，正常少數(shù)民族育齡女性45 例，反復(fù)妊娠失敗及早發(fā)性卵巢功能不全少數(shù)民族患者27 例；少數(shù)民族FMR-1 基因CGG 重復(fù)序列異常發(fā)生率并不比漢族高，考慮與少數(shù)民族樣本量少有關(guān)。

綜上所述，新疆少數(shù)民族與漢族FMR-1 基因的CGG 重復(fù)序列分布相同，未發(fā)現(xiàn)少數(shù)民族CGG重復(fù)序列灰區(qū)發(fā)生率較漢族高。漢族育齡女性中，反復(fù)生育失敗和早發(fā)性卵巢功能不全患者較正常育齡女性灰區(qū)發(fā)生率高。