六味地黃丸治療圍絕經期綜合征的網絡藥理學研究

張 蕊

（南京市浦口區中醫院內分泌科，江蘇 南京 211800）

圍絕經期綜合征（perimenopausal syndrome）也稱為更年期綜合征。絕經的本質是卵巢功能的衰竭，而不是月經的有無。圍絕經期是從臨床表現、內分泌激素及生物學上出現絕經趨勢到最后一次月經后1 年的特殊生理階段[1]。在這一時期，患者可能出現一系列表現為植物神經功能紊亂、伴有神經心理等改變的一組癥候群[2]；就診時常有諸多不適主訴，嚴重者影響其正常的工作、生活。現代醫學治療手段主要包括飲食、運動及心理干預、激素替代治療及非激素類藥物治療（如安定、谷維素等）。激素替代治療有一定的適應證及禁忌證，同時要注意隨訪管理，評估心血管、靜脈血栓、認知功能、腫瘤等相關疾病的風險與獲益情況[3]。中醫藥治療本病效果顯著，且安全性高。近年來相關中成藥亦開發頗多，六味地黃丸作為經典方劑，臨床應用廣泛，基于此，本研究主要通過網絡藥理學研究方法，探討六味地黃丸通過多成分、多靶點、多通路治療圍絕經期綜合征的作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 六味地黃丸中活性成分及相關靶點的篩選 通過TCMSP 平臺[4]檢索六味地黃丸中六味中藥（熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓）的化學成分，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，同時滿足類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的2 個ADME 屬性值為篩選條件，獲取六味地黃丸中的活性化合物及相關靶點信息。

1.2 圍絕經期綜合征相關靶點篩選 在GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫檢索“menopausal syndrome”潛在靶點信息，并進入DRUGBANK 數據庫尋找治療圍絕經期綜合征的西藥作用靶點加以補充。

1.3 六味地黃丸活性成分-圍絕經期綜合征靶點PPI網絡構建 將六味地黃丸活性成分靶點與圍絕經期綜合征靶點取交集并繪制韋恩圖。通過STRING 11.0數據庫（https://string-db.org）將所得二者交集靶點信息構建蛋白質相互作用（PPI）網絡模型[5]，設定生物種類為“Homo sapiens”，隱藏沒有連線的節點，所有設置均為默認值，得到PPI 網絡，并通過CytoScape3.7.1軟件進行作圖，同時利用MCODE 插件對PPI 網絡進一步分析，得到潛在蛋白質功能模塊。

1.4 六味地黃丸活性成分-圍絕經期綜合征靶點功能于通路的富集分析 將六味地黃丸治療圍絕經期綜合征靶點錄入MetaScape（http://metascape.org/gp/index.html）平臺[6]，設置P＜0.01，對其生物學過程及代謝通路進行富集分析，將所得結果利用在線平臺微生信（http://www.bioinformatics.com.cn）作圖可視化。

1.5 六味地黃丸活性成分-圍絕經期綜合征靶點-通路網絡圖的構建 運用軟件CytoScape 3.7.1 構建六味地黃丸活性成分-圍絕經期綜合征靶點-通路網絡圖，利用CytoScape 3.7.1 分析活性成分及靶點的網絡拓撲參數，包括節點連接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）和緊密度（Closeness Centrality）等，結合上述參數判斷核心靶點及活性成分。

2 結果

2.1 六味地黃丸中活性成分及相關靶點的獲取 在T CMSP 平臺經ADME 篩選后獲得熟地黃2 種、山藥12種、山茱萸14 種、澤瀉7 種、牡丹皮5 種、茯苓6 種活性成分，合并后刪除重復值共獲得41 種六味地黃丸的活性成分，主要活性成分見表1。將其活性成分輸入TCMSP 平臺檢索得到經uniprot 規范后的靶標102 個。

表1 六味地黃丸部分活性成分表

2.2 圍絕經期綜合征相關靶點的獲取 通過GeneCards 數據庫檢索獲得圍絕經期綜合征潛在靶點3325 個，在OMIM 數據庫檢所獲得潛在靶點623個，經DRUGBANK 數據庫補充39 個，合并后去重最終獲得3902 個靶點。

2.3 六味地黃丸活性成分-圍絕經期綜合征靶點PPI網絡構建 將六味地黃丸活性成分靶點與圍絕經期綜合征靶點取交集后獲得交集靶點64 個。在STRING 11.0 數據庫輸入二者交集靶點信息，構建PPI 網絡模型，隱藏沒有連線的節點，下載TSV 文件導入CytoScape 3.7.1 作圖，六味地黃丸-圍絕經期綜合征靶點PPI 網絡見圖1。利用MCODE 插件對PPI網絡進一步分析，獲得主要潛在核心模塊，見圖2。

圖1 六味地黃丸-圍絕經期綜合征靶點PPI 網絡

圖2 PPI 網絡核心模塊

2.4 六味地黃丸活性成分-圍絕經期綜合征靶點的富集分析 將交集靶點輸入MetaScape 數據平臺進行GO 及KEGG 富集分析，所得數據輸入微生信網站進行可視化，結果顯示多個靶點的功能參與圍絕經期綜合征的治療。六味地黃丸主要參與的生物學過程包括細胞對有機環狀化合物的反應（cellular response to organic cyclic compound）、循環系統過程（circulatory system process）、對類固醇激素的反應（response to steroid hormone）、神經遞質水平的調節（regulation of neurotransmitter levels）；參與KEGG通路主要有雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、內分泌抵抗（endocrine resistance）、膽堿能突觸（cholinergic synapse）、血清素突觸（serotonergic synapse）等；相關靶點治療圍絕經期綜合征的細胞成分有樹突（dendrite）、突觸后（postsynapse）、受體復合物（receptor complex）、過氧化物酶體（peroxisome）等；生物功能主要有核受體活性（nuclear receptor activity）、突觸后神經遞質受體活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）、兒茶酚胺結合（catecholamine binding）、激素結合（hormone binding）等，見圖3。

圖3 六味地黃丸治療圍絕經期綜合征靶點富集分析

圖3 六味地黃丸治療圍絕經期綜合征靶點富集分析（續）

2.5 六味地黃丸活性成分-圍絕經期綜合征靶點-通路網絡圖的構建 將所得成分、靶點、通路信息輸入CytoScape 3.7.1 構建六味地黃丸成分-圍絕經期綜合征靶點-通路網絡，有163 個節點，461 條邊；通過CytoScape 3.7.1 內置的NetworkAnalyzer 分析預測顯示，山奈酚為六味地黃丸治療圍絕經期綜合征的主要成分，其次為β-谷甾醇、豆甾醇及四氫石氨酸等，見表2。NCOA2、PTGS2、PRKACA、PGR、PTGS1 為預測六味地黃丸治療圍絕經期綜合征主要的靶點。根據連接度截取前10 位靶點信息見表3。

表2 六味地黃丸主要活性成分網絡節點參數

表3 六味地黃丸主要活性成分靶點網絡節點特征參數

3 討論

《素問·上古天真論》有云“女子七歲，腎氣盛，齒更發長，二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通”，此為中醫古籍中對于月經的認識，而絕經前后諸證并無相對應的病名，多根據其臨床表現的不同，歸屬于“百合病”“郁病”“臟躁”“汗證”范疇。因此，對于其病因病機的認識有多個不同角度的闡釋。腎藏先天之精，主生長發育、生殖，主一身之陰陽，故而從腎論治為基本大法。六味地黃丸系宋代醫家錢乙從《金貴要略》的腎氣丸加減而成。去溫陽之桂、附，用治腎怯諸證。經歷代醫家應用，指出六味地黃丸主治肝腎不足，且有三陰并治之效。何若蘋[7]認為圍絕經期綜合征病機為腎陰不足，臨癥多選用六味地黃丸加減治療本病，靈活辨證加減運用均有良好效果。胡桂梅[8]研究顯示，應用六味地黃丸加減結合健康指導治療及僅應用六味地黃丸加減治療的總有效率均大于70%。張改芝[9]研究顯示，經六味地黃丸治療組總有效率達96.42%，明顯優于對谷維素+維生素B1治療的62.50%。伍三妹等[10]研究顯示，六味地黃丸聯合谷維素治療組總有效率為84.5%，優于尼爾雌醇對照組的75.2%。由此可見，六味地黃丸治療圍絕經期綜合征有一定的理論基礎，且臨床療效良好。

本研究應用網絡藥理學方法，探討六味地黃丸治療MPS 的作用機制，結果顯示山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、四氫石氨酸、卡舒勒酮、漢西酮C、常春藤素等活性成分為六味地黃丸治療圍絕經期綜合征潛在成分。研究證實[11，12]，異黃酮、黃酮是植物雌激素，山奈酚屬于黃酮類化合物，是一種選擇性雌激素受體調節劑，細胞實驗發現不同濃度下的山奈酚可選擇性激動雌激素受體。有動物實驗發現[13]，山奈酚可抑制卵巢切除引起的骨質減少大鼠模型的骨質流失，改善骨質疏松。β-谷甾醇和豆甾醇均為植物甾醇，屬于植物類固醇，研究發現[14]，植物甾醇可降低絕經后女性心血管疾病及骨質疏松風險。植物甾醇酯可改善膽堿能活性，對飲食誘導的認知缺陷大鼠有神經保護作用[15]。豆甾醇可以改善氯胺酮誘導的小鼠行為、生化和組織病理學改變，具有治療精神病癥狀方面的潛在作用[16]。四氫石氨酸是一種吲哚類生物堿，可選擇性拮抗α-2 腎上腺能受體拮抗劑，阻斷升壓反應[17，18]。吲哚生物堿在尼日利亞用于治療精神疾病，與奧氮平有相當的抗精神病效果，且具有抗焦慮作用[19，20]。動物實驗顯示[21，22]，常春藤素具有抗抑郁活性成分，可保護小鼠免受卵巢切除術誘導的骨質流失，改善絕經后骨質疏松。以上研究結果表明六味地黃丸主要成分中含有植物雌激素可從病因出發治療圍絕經期綜合征，同時可兼顧圍絕經期女性其他系統疾病，如循環系統心血管疾病風險、骨質疏松、焦慮抑郁神經系統癥狀等，體現了中藥復方通過多成分干預疾病的特點。

本研究篩選得到NCOA2、PTGS2、PRKACA、PGR、PTGS1、HSP90AA1、NR3C2、ADRB2、CHRM3、TP53 等為六味地黃丸治療圍絕經期綜合征的核心靶點。NCOA2，也稱SRC-2，為核激素受體（包括類固醇、甲狀腺、類視黃醇和維生素D 受體）的轉錄共激活劑。核受體共激活劑家族包括3 個不同但功能和結構相關的成員，即SRC-1/NcoA1、SRC-2/NCOA2/TIF2 和SRC-3/RAC3/。在SRC-2 基因缺失小鼠子宮的微陣列研究表明[23]，SRC-2 參與雌激素、Wnt 和骨形態發生蛋白（BMP）生長因子信號通路的調節以及孕激素抑制的特定基因的表達。PTGS2，也稱COX2，PTGS1 為PTGS2 的旁系同源物，二者均為前列腺素合成的關鍵酶。前列腺素在調節分娩中起重要作用，研究發現[24，25]，COX 在排卵、受精、著床和蛻膜等生殖功能中具有重要作用，COX2 缺陷小鼠會出現不育、排卵及受精缺陷。雌激素的動脈粥樣硬化保護作用是通過前列腺素Ⅰ2（PGⅠ2）的產生和COX2 的激活引起的，COX2 與雌激素的關系可解釋心臟病的性別差異及圍絕經期女性心血管疾病風險增加[26]。PRKACA 是cAMP 依賴性蛋白激酶催化亞基α，基因編碼蛋白激酶A 的催化亞基之一，大量的激素、神經遞質和其他信號物質利用腺苷3',5'環磷酸腺苷（cAMP）作為細胞內的第二信使，cAMP 參與許多不同的生理反應，包括細胞生長和分化、神經遞質的突觸釋放和離子通道傳導等[27，28]。PGR 為孕激素受體，該基因編碼的蛋白質介導孕酮的生理作用，在排卵前卵泡的顆粒細胞中被誘導以響應LH 激增，并且已被證明對排卵至關重要[29]。NR3C2，也稱鹽皮質激素受體MR，是PGR 的旁系同源物，二者及雄激素、糖皮質激素受體均為NR3C 類的核激素受體，MR 主要介導醛固酮對鹽和水平衡的作用，與圍絕經期高血壓及水腫癥狀有相關性。HSP90AA1為熱休克蛋白90Alpha Family A 類成員，該基因編碼的蛋白質是一種可誘導的分子伴侶，參與諸多信號通路，維持著幾種核激素受體，如雌激素受體[30]。ADRB2、CHRM3 均為G 蛋白偶聯受體超家族的成員。在性腺切除的ADRB2 缺陷小鼠中，骨吸收無法增加，可見交感神經信號的完整性對于性腺衰竭引起的骨吸收增加是必要的[31]。CHRM3 存在于全身的平滑肌、心肌、外分泌腺以及中樞和外周神經系統的神經元中，研究發現[32]，CHRM3 對快速眼動睡眠至關重要。

KEGG 富集分析結果顯示，六味地黃丸主要通過雌激素信號通路、內分泌抵抗、膽堿能突觸、血清素突觸等信號通路治療圍絕經期綜合征。雌激素可調節月經周期和生殖、骨密度、腦功能、膽固醇動員、乳房組織和性器官的發育以及控制炎癥。雌激素信號通路主要負責控制女性生殖系統的功能，以及在青春期和性成熟期間出現的第二性征的發育[33]。乙酰膽堿作為中樞神經系統、神經節和神經肌肉接頭的膽堿能突觸的遞質，膽堿能突觸對記憶功能、成癮、焦慮和情緒調節至關重要[34]。血清素（5-HT）介導的調節活動會影響大腦的各種功能，包括工具性和認知性，其與精神疾病的病理生理學有關，例如精神分裂癥、抑郁癥、廣泛性焦慮癥、恐慌癥和強迫癥等[35，36]。上述報道側面說明了本研究預測結果的可靠性。

綜上所述，本研究篩選出的多個靶點及其生物學進程、信號通路均與圍絕經期綜合征生理病理變化密切相關。六味地黃丸中的多個活性成分，作用于多個靶點，通過多種信號通路干預圍絕經期綜合征。本研究初步探討了六味地黃丸治療圍絕經期綜合征的作用機制，因中藥復方成分復雜，同一靶點富集于多個通路，具有多種生物功能，是否存在競爭或協同機制尚不明確，仍有待進一步研究。