S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因對銀腺楊84K抗旱性的影響*

姚俊廣 耿 婭 劉依靜 安 軼 黃李超 曾 為 盧孟柱

(浙江農林大學林業與生物技術學院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

我國森林覆蓋率低，木材蓄積量低。作為木制品消費大國，木材供應嚴重不足。隨著經濟的發展，木材需求量日益增多。20世紀末至21世紀初，我國營造了超過1 000萬hm2的速生林基地，成為世界上人工林面積最大的國家(主楚杰等， 2015)。楊樹(Populus)作為重要的速生人工林樹種，已成為解決木材供需矛盾的重要途徑。我國大約有50%以上的地區屬于干旱或半干旱，其中半干旱地區的人工造林成活率約為 30%，而干旱區僅為4%(黃榮輝等， 2012)。干旱已經成為嚴重阻礙各地區林業發展以及改善生態環境的重要因素之一，了解樹種對干旱脅迫響應以及如何提高其抗逆性具有至關重要的意義。楊樹人工林在干旱、半干旱地區的發展，依賴于抗逆品種。

脅迫條件下，植物能夠做出相應的防御機制，包括形態調節以及生理生化反應(Pandeyetal., 2015)。Todorova等(2015)研究發現內源多胺含量升高是植物響應脅迫反應之一，對植物的抗逆性具有至關重要的作用。多胺作為一類帶正電荷的脂肪族類化合物，普遍存在于動植物體內(Taboretal., 1984)，可參與調節細胞分裂(Evansetal., 1989)、果實成熟(Guoetal., 2018)等植物發育過程，也可響應低溫、干旱等脅迫途徑(Liuetal., 2015)。高等植物的多胺主要分為腐胺(Put)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)、以及熱精胺(T-spm)4類(Takanoetal., 2012)。腐胺和亞精胺是最常見的多胺，精胺主要存在于種子植物、多數動物和一些細菌中(Peggetal., 2010)，而熱精胺存在于整個植物界中(Eugenioetal., 2008)。多胺的合成途徑受多種相關酶的催化，其合成過程主要有2種： 以鳥氨酸(ornithine, Orn)為底物，在鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)催化下，將鳥氨酸直接轉化為腐胺的直接途徑； 以精氨酸(arginine，Arg)為底物，在精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase, ADC)催化以及經N-氨甲酰腐胺脫去一分子氨，生成腐胺的間接途徑。而腐胺能夠作為亞精胺、精胺生物合成途徑的主要前體。在亞精胺合成酶(spermidine synthases, SPDS)的催化下生成亞精胺，亞精胺在精胺合成酶(spermine synthases, SPMS)以及熱精胺合成酶(thermospermine synthases, TSPMS)催化下分別生成精胺和熱精胺(Walters, 2003; Tiburcioetal., 2014)。在合成亞精胺和精胺途徑上，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)在S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)催化下，生成脫羧后的S-腺苷甲硫氨酸(decarboxylated S-adenosylmethionine, dcSAM)，提供亞精胺和精胺合成所需要的氨丙基，成為多胺合成途徑上重要的限速步驟(Huetal., 2005)。

施加外源多胺，可以保護植物免受脅迫損傷。干旱脅迫下，對植株葉片噴施腐胺能夠有效改善植株水分狀況，提高植物的生物量，增強干旱脅迫耐受性 (Guptaetal., 2012; Hussainetal., 2013; Zhuetal., 2019)。內源提高多胺相關酶基因的表達水平，可進一步證明多胺對于非生物脅迫的適應性(Pathaketal., 2014; Shietal., 2014; Liuetal., 2015)。在鹽脅迫下，過表達SAMDC可使水稻(Oryzasativa)生物量增加，內源Spd、Spm的積累提高了抗脅迫能力(Royetal., 2002)。甜菜(Betavulgaris)M14-SAMDC基因異源轉化擬南芥(Arabidopsisthaliana)，擬南芥Spd和Spm含量增加，植株表現出強耐鹽性(Jietal., 2019)； 干旱脅迫下，辣椒(Capsicumannuum)CaSAMDC異源轉化擬南芥，其過表達CaSAMDC植株亞精胺、精胺含量顯著升高，植株耐旱性顯著增強(Sooetal.， 2014)。因此，通過改變植物中精胺含量，可以調控植物的抗逆性。

楊樹作為多年生木本植物，其生長發育長期受到各種脅迫的制約，研究其抗逆機制具有重要意義。本研究以PagSAMDC4a轉基因銀腺楊84K(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)作為試驗材料，研究其在干旱條件下生長發育的變化，進一步分析脅迫條件下植株內源多胺水平差異，系統地揭示楊樹內源性多胺在干旱脅迫反應中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀腺楊84K為筆者試驗室保存，干旱脅迫處理所用過表達PagSAMDC4a株系為試驗室前期研究所獲得，經定量PCR檢測后選取過表達PagSAMDC4a轉基因銀腺楊3個株系(PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17)進行研究。組培苗生長1個月后進行土培，在裝有混合基質(泥炭︰蛭石︰珍珠巖體積比為3︰9︰1)的育苗盆培養3個月，培養條件為： 溫度23～25 ℃，相對濕度60%，光周期16 h光照/ 8 h黑暗，光照強度50 μmol · m-2s-1。

1.2 干旱脅迫處理

以生長3個月的未轉基因銀腺楊84K及其過表達PagSAMDC4a轉基因株系為材料，設置對照組和干旱脅迫組。對照組保持充分水量，確保育苗盆中混合基質的水分含量保持在約70%； 干旱脅迫組模擬自然干旱的模式，處理時間為6天，土壤含水量降至約25%，未轉基因84K楊葉片出現嚴重枯萎現象。觀測植株的生長狀況并取材進行相關指標的測定。

1.3 干旱脅迫下相關指標的測定

在干旱處理第6天，分別取未轉基因銀腺楊84K和過表達PagSAMDC4a植株葉片，測定相關指標。

1.3.1 內源多胺含量 取未轉基因植株、過表達PagSAMDC4a植株由上至下第4和第5片葉片測定多胺含量(林紹艷等， 2016)。具體步驟： 配制腐胺、亞精胺、精胺標準品； 樣品加入5%高氯酸浸提以及后續樣品、標準品的衍生化處理； 使用超高效液相色譜儀(UPLC)進行多胺含量測定，選用色譜柱Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3.0 mm×2.7 μm)，設置參數： 流動相乙腈和水(體積比40︰60),流速為0.5 mL·min-1，檢測波長為230 nm，進樣體積為5 μL； 同時測定標準品腐胺(Put)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)建立標準曲線(表1)。

表1 多胺測定的回歸方程和相關系數①

1.3.2 過氧化氫(H2O2)含量 取植株由上至下第1～3片葉片，參考H2O2檢測方法(Leietal., 2013)，選用H2O2檢測試劑盒(A064-1-1)、蛋白定量(TP)測定試劑盒(A045-2)(南京建成生物工程研究所)，測定樣品蛋白濃度(考馬斯亮藍測定法)以及H2O2與鉬酸作用形成的絡合物在波長405 nm處吸光值，計算H2O2含量： H2O2含量(mmol·g-1prot)=(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(163 mmol·L-1)÷待測樣品蛋白濃度(g prot·L-1)。

1.3.3 葉片相對含水量 取正常情況以及干旱脅迫處理的未轉基因銀腺楊84K、過表達PagSAMDC4a植株的由上至下第7片葉片測定含水量。首先取下新鮮的葉片后立即稱量葉片的鮮質量(FW)，而后把葉片浸沒于水中室溫放置24 h后稱量葉片浸水后的質量(TW)。再將新鮮葉片放置在80 ℃恒溫干燥箱里干燥72 h后，稱量葉片的干質量(DW)。計算葉片相對含水量(Heetal., 2018)： (FW-DW)/(TW-DW)×100%。

1.3.4 葉片失水率 取正常情況下未轉基因銀腺楊84K、過表達PagSAMDC4a植株由上至下第8片葉片，分別稱取葉片的鮮質量(FW)，每隔0.5 h稱量1次(desiccated weight)，總時間為4.5 h。最后將葉片放置80 ℃烘箱里烘干過夜，稱其干質量(DW)。計算葉片失水率(Boetal., 2017)： 葉片失水率(%)=(FW-desiccated weight)/(FW-DW)×100%。

1.3.5 電解質滲透率 取正常情況以及干旱脅迫下的未轉基因銀腺楊84K、過表達PagSAMDC4a植株由上至下第6片葉片測定電解質滲透率。首先用去離子水清洗葉片，經濾紙擦干葉片表面后，使用打孔器打出10片小圓片放入裝有2 mL ddH2O的離心管中，完全浸泡并真空抽濾10 min后，向離心管中加入6 mL ddH2O，室溫放置200 r·min-1搖床中振蕩1 h，測其電導率為S1； 將離心管放置90 ℃水浴20 min，待溶液冷卻至室溫后充分搖勻，測定其電導率為S2。計算電解質滲透率(%)=(S1/S2)×100%。

1.4 數據分析

所有試驗均進行10次生物學重復，樣本數據采用SPSS 17.0數據處理軟件進行獨立樣本t檢驗，在0.01水平上檢驗差異顯著性，并用Excel或GraphPad prism8進行數據分析、圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 PagSAMDC4a轉基因銀腺楊84K內源多胺含量

經定量PCR分析，銀腺楊84K轉基因株系PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17的基因表達量均顯著高于未轉基因植株，且基因表達量依次由低到高(圖1A)。測定轉基因株系和未轉基因植株的內源多胺含量(圖1B)，采用UPLC測定多胺標準品和樣品的色譜圖(圖1C、D)，根據不同的標準品濃度、色譜峰面積計算標準曲線(表1)。在水分正常情況下，3個轉基因株系的內源亞精胺、精胺含量都顯著高于未轉基因對照，其中PagSAMDC4a-OE#17株系的內源腐胺、亞精胺、精胺含量分別是未轉基因對照的1.95、3.43、1.32倍(表2)。

2.2 干旱脅迫下PagSAMDC4a轉基因銀腺楊84K葉片相關生理指標

干旱脅迫影響植株的生長發育，且在葉片表型方面尤其明顯。正常水分條件下，與未轉基因對照相比，過表達PagSAMDC4a植株的葉片表型(圖2A)、葉片相對含水量(圖2B)、電解質滲透率(圖2C)并無顯著差異，但葉片失水較慢，失水率由高到低為未轉基因對照、PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17(圖2 D)。在干旱脅迫下，未轉基因植株表型出現明顯變化，葉片嚴重萎蔫下垂，表現對干旱脅迫的敏感性； 而過表達PagSAMDC4a植株葉片出現不同程度的響應，PagSAMDC4a-OE#3植株葉片輕度萎蔫，PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17植株葉片生長狀況正常，表現出了耐旱性(圖2A)。同時測定葉片相對含水量、電解質滲透率等相關指標后發現，在干旱脅迫下，未轉基因對照的葉片相對含水量比正常供水條件下降低26.44%(圖2B)，電解質滲透率升高27.68%(圖2C)； 而PagSAMDC4a-OE#3、PagSAMDC4a-OE#15、PagSAMDC4a-OE#17植株葉片相對含水量比正常供水條件下分別降低10.9%、3.66%、1.33%(圖2B)，電解質滲透率與正常供水條件下無顯著差異(圖2C)。過表達PagSAMDC4a植株電解質滲透率較低、變化幅度較小，葉片的相對含水量較高，并與未轉基因對照差異顯著，表明其抗旱性明顯加強。

2.3 干旱脅迫下PagSAMDC4a轉基因銀腺楊84K葉片內源H2O2含量

為驗證干旱脅迫下84K楊植株氧化損傷情況，測定正常供水及干旱脅迫下植株葉片的H2O2含量(圖3)。在正常供水條件下，相比未轉基因對照，轉基因植株的H2O2含量顯著降低，H2O2含量由高到低依次為未轉基因對照 >PagSAMDC4a-OE#3 >PagSAMDC4a-OE#15 >PagSAMDC4a-OE#17。干旱脅迫6天后，未轉基因對照的H2O2含量顯著升高，而過表達PagSAMDC4a植株H2O2含量增加幅度顯著低于對照，含量由高到低為未轉基因對照 >PagSAMDC4a-OE#3 >PagSAMDC4a-OE#15 >PagSAMDC4a-OE#17。以上結果表明過表達PagSAMDC4a明顯增強了轉基因84K楊的抗旱性。

圖1 PagSAMDC4a轉基因84K楊的基因表達及多胺含量

表2 PagSAMDC4a轉基因84K楊葉片中3種多胺含量①

圖2 干旱脅迫下過表達PagSAMDC4a植株相關生理指標的變化

圖3 干旱脅迫下PagSAMDC4a轉基因84K楊的H2O2含量

3 討論

干旱嚴重影響植物生長發育以及生物量積累(Yinetal., 2014)，阻礙干旱、半干旱地區的植物生長。植物內源性多胺影響植物的生長發育以及脅迫響應，在干旱、低溫、高溫以及機械損傷等多種脅迫下，植物能產生大量的多胺物質(Alczaretal., 2006; Marcoetal., 2011)。植物外源施加多胺或者異源表達多胺合成酶，都能增強植物抵御脅迫的能力。多胺合成涉及多個酶促反應，相關酶基因的作用及其對多年生木本植物的影響有待研究。

提供氨丙基的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)在多胺合成途徑上發揮著關鍵作用。因此，本研究通過對SAMDC4a過表達銀腺楊84K植株進行干旱脅迫，分析了SAMDC4a基因差異表達導致植物體內源多胺含量變化對植株抗逆性的影響。干旱脅迫后，過表達SAMDC4a植株葉片呈現不同的響應狀態，隨著基因表達量的升高，其內源亞精胺和精胺含量都隨之增加。這進一步說明過表達SAMDC4a植株基因表達差異影響內源多胺含量，SAMDC4a基因表達升高導致植株多胺含量增加，進而增強對干旱脅迫的耐受性。此外，為完全評估SAMDC4a基因在抗逆性中的作用，后期應對SAMDC4a進行基因沉默或RNA干擾，進一步研究SAMDC4a基因表達量降低對多胺含量及抗逆性的影響。

植物在受到脅迫時，電解質滲透率是分析植物發生損傷的重要標準，同時電解質滲透率的測定結果可用來評估逆境脅迫后的細胞活力(Busaidietal., 2015)。據報道在低溫脅迫下，對黃瓜(Cucumissativus)幼苗施加外源腐胺和亞精胺，能有效降低黃瓜葉片的電解質滲透率，對低溫產生相應的抗逆性(Zhangetal., 2009)。本試驗在干旱脅迫后，未轉基因銀腺楊84K的電解質滲透率顯著升高，而過表達SAMDC4a植株的滲透率變化幅度較小，且維持在較低水平，這表明通過改變植株內源多胺含量，可以對植株電解質的滲透有重要影響，穩定了細胞透性，減少了對細胞的傷害。葉片相對含水量是衡量植株響應干旱脅迫的重要生理指標，可用來評估植物抗旱能力。在正常供水情況下，過表達SAMDC4a轉基因銀腺楊84K植株與未轉基因植株的葉片相對含水量無顯著差異； 但在干旱脅迫下，轉基因植株葉片相對含水量顯著高于未轉基因對照。與之相反，過表達SAMDC4a轉基因植株在正常供水情況下的葉片失水率顯著低于未轉基因對照。這些結果表明，多胺通過增強葉片持水能力，減少葉片水分丟失，進而有效緩解植株葉片所受水分脅迫，從而改善葉肉細胞中水分狀況，在有限的水分供應下保證植株正常生長(Farooqetal., 2009)。

本研究表明，多胺合成關鍵酶基因SAMDC4a過量表達加速了多胺(尤其是亞精胺、精胺)的合成，促進了多胺的積累，并間接引起多胺相關的生理、生化變化。H2O2作為多胺代謝相關產物之一(Groppaetal., 2008; Alczaretal., 2010)，在植物應對逆境脅迫中具有重要影響。在多種脅迫條件下，多胺能夠緩解活性氧(ROS)帶來的損傷、激活抗氧化機制，對各種脅迫產生抗逆性(Seoetal., 2019)。H2O2作為活性氧主要類型之一，在植株干旱脅迫下的積累是造成植株自身損傷的一個重要途徑。對植株施加外源多胺時，會導致植株H2O2含量下降、抗氧化機制的激活、ROS水平顯著降低等，可以緩解干旱脅迫的影響(Satishetal., 2018; Hassanetal., 2018; 2020)。本研究表明，過表達SAMDC4a銀腺楊84K，在干旱脅迫下的H2O2含量變化幅度較小，且顯著低于未轉基因對照植株，進一步表明多胺可以減少活性氧積累，減輕干旱脅迫引起的氧化損傷程度。說明過表達SAMDC4a基因能增強楊樹抗旱能力，增強對環境脅迫的抗逆性。

4 結論

S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC4a)過表達的銀腺楊84K可通過提高植株內源多胺含量，從而增強葉片的持水能力，減輕ROS積累，維持正常的細胞滲透能力，在干旱脅迫下增強對干旱脅迫的抗性，說明內源多胺在木本植物響應干旱脅迫過程中有重要作用。這為揭示楊樹多胺在抗逆性方面的作用提供了重要依據，對選育抗逆新品種具有潛在的應用價值。