骨痹止痛丸對腎陽虛大鼠軟骨調控作用機制研究

楊朔 楊杰 章敬程 幺寶金 冷向陽

中醫“腎主骨”理論在防治骨疾病方面具有重要價值。腎主骨，治腎亦治骨，從腎論治骨科疾患是歷代醫家長期遵循的治病原則，一直以來對中醫骨傷科臨床實踐起到了重要的指導作用。對于腎主骨相關機制的研究[1-4]和臨床實踐正在不斷深入。骨痹止痛丸出自“天池傷科”流派第三代傳人國醫大師劉柏齡教授之手，是劉老以腎主骨理論為基礎研發的頗具代表性的經驗方。此方中含有淫羊藿、骨碎補等溫補腎陽之要藥，目前已制成長春中醫藥大學附屬醫院院內制劑。在臨床實踐中，課題組發現骨痹止痛丸對骨性關節炎等退行性疾病確有療效，尤其適用于腎陽虛證者，但其具體作用機制尚未完全明確。本文旨在研究骨痹止痛丸調控腎陽虛大鼠軟骨的作用機制，為骨痹止痛丸的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6周齡雄性大鼠30只，體質量(200±20)g，購自遼寧長生生物科技有限公司，實驗動物許可證號： SCXK (遼) 2020-0001。 動物實驗經長春中醫藥大學動物研究倫理委員會批準(批準編號：2021411)。動物自由飲水和進食，在溫度(25±1)℃、濕度50%、12小時光照條件下飼養。

1.2 實驗藥物

本實驗中所使用的骨痹止痛丸為長春中醫藥大學附屬醫院院內制劑(批號：吉藥制字Z20170048)，由長春中醫藥大學附屬醫院提供。具體藥物組成包括：淫羊藿15 g、骨碎補15 g、萊菔子6 g、雞血藤10 g、鎖陽10 g、熟地黃20 g、狗脊15 g。制備方法如下：將上述7種藥物按固定比例進行混合，以蒸餾水浸泡(水面沒過藥材3 cm)；浸泡2小時后，用砂鍋將藥物和浸泡液煮沸30分鐘，使用絹布過濾回收第一次所得藥液，藥渣留于砂鍋內；再向砂鍋中加入蒸餾水，繼續沸水煎煮1小時，使用絹布過濾收取第二次所得藥液，重復操作1次；將3次所得藥液進行混合，通過旋轉蒸發儀濃縮獲得浸膏，4℃保存[4]。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠聯酶免疫吸附法(enzyme unked immunsoybent assay,ELISA)試劑盒(上海優選生物科技有限公司，批號：202006C)，總RNA提取試劑盒(BioTek公司，批號：11752053)，TRIzol Reagent(Invitrogen公司，批號：10296028)，蘇木素染色液(珠海貝索生物科技有限公司，批號：BA-4097)，伊紅染色液(珠海貝索生物科技有限公司，批號：BA-4022)，熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，批號：4472920)，氫化可的松混懸液(天津金耀藥業有限公司，規格20 mL∶100 MG，批號：2103008S)，4%多聚甲醛溶液(Beyotime公司，批號：P0099)。

高速離心機(Eppendorf公司)，Infnite 200 PRO型酶標儀(Life Science公司)，PCR儀(Eppendorf公司)，紫外可見分光光度計(日本島津公司)，FA1004N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，Leica RM2255型石蠟切片機(德國Leica公司)，Leica EG1140石蠟包埋機(德國Leica公司)，OlympusBX51光學顯微鏡(日本Olympus公司)，NIS-ELEMNTBR型圖像分析系統(日本NIKON公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥 所有大鼠適應性喂養1周后隨機分為3組，每組10只，分別為對照組、腎陽虛組和骨痹止痛丸組。對照組大鼠后肢肌肉注謝0.9%生理鹽水0.3 mL，每日1次，連續22天。腎陽虛組大鼠后肢肌肉注射氫化可的松混懸液2.5 mg/100 g，每日1次，連續進行22天。骨痹止痛丸組大鼠后肢肌肉注射氫化可的松混懸2.5 mg/100 g，每日1次，連續22天，從第8天開始，按1.05 g/(kg·d)(體表面積折算法人等效劑量)的標準劑量給予骨痹止痛丸水溶液連續灌胃給藥[5]，每天灌胃1次，連續進行15天，直至第22天。

1.4.2 動物組織取材 本研究中30只大鼠無死亡情況，在末次給藥后12小時，各組大鼠分別用乙醚進行麻醉，而后進行腹主動脈取血。血液離心后取血清并保存在-20℃冰箱中(離心條件：4℃ 3000 r/min離心10分鐘)。大鼠處死后取腎臟和整個膝關節，分離軟骨組織，一側腎臟和膝關節軟骨放于凍存管中，-80℃保存；另一側腎臟和膝關節軟骨用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般情況 每日觀察大鼠形態及行為學變化，每3日測量各組大鼠體質量并記錄。

1.5.2 ELISA檢測血清激素 從每組中隨機抽取3只大鼠進行檢測，具體操作步驟按照ELISA試劑盒說明書進行，檢測指標包括促腎上腺皮質激素(adreno cortico tropic hormone，ACTH)、皮質醇(cortisol，CORT)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和睪酮(testosterone，T)

1.5.3 腎臟和膝關節軟骨組織病理切片 用4%的多聚甲醛溶液將大鼠一側腎臟和膝關節軟骨組織固定過夜，然后進行石蠟包埋，切片機切成3 mm的組織切片，最后用蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在光學顯微鏡下進行拍照觀察。

1.5.4 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測基因表達水平 從每組中隨機抽取3只大鼠，采用qRT-PCR法檢測各組大鼠膝關節軟骨中Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因的表達水平。引物序列見表1，以Gapdh為表達的內參，采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 數據處理

2 結果

2.1 各組大鼠體質量與形態變化

腎陽虛組大鼠體質量相比于對照組明顯下降(P<0.05)，經骨痹止痛丸治療后，體質量增加，見表2。此外，腎陽虛組大鼠還出現了疲勞、活動減少、聚集傾向、怕冷、食欲下降、毛發脫落等一系列行為和生理特征，提示腎陽虛造模成功。

表2 各組腎陽虛大鼠體質量比較

2.2 各組大鼠血清激素水平變化

與對照組相比，腎陽虛組大鼠血清中ACTH、T、LH、CORT等激素水平明顯下降，經骨痹止痛丸治療后，略有上升，提示大鼠腎陽虛得到改善[6]見表3。

表3 各組腎陽虛大鼠血清激素水平比較

2.3 各組大鼠腎臟、膝關節軟骨病理切片情況

對照組腎臟腎小管和腎小球均未見異常變化；腎陽虛組腎小球擴張，近曲小管變性，遠曲小管擴張；骨痹止痛丸組腎小球擴張程度相比腎陽虛組減輕，腎小管功能狀態改善，近曲小管未見明顯變性，遠曲小管未見明顯擴張。見圖1。

注：A 對照組；B腎陽虛組；C 骨痹止痛丸組。

對照組膝關節軟骨表現為軟骨面光滑連續，軟骨細胞數量豐富，細胞分布層次較多，軟骨下骨質內骨小梁寬大，分布呈網狀，分布密集。腎陽虛組膝關節軟骨面失去光滑連續的表面結構，軟骨層表面塌陷，凹凸不平，可見纖維成分增生增多，并有少量脂肪組織化生；軟骨層明顯變薄，軟骨細胞固縮，軟骨基質成分明顯減少，軟骨囊內同源軟骨細胞群分布明顯減少，軟骨骨小梁成分分布減少，骨小梁變細變長，骨小梁間連接減少。軟骨層所體現的軟骨成分與骨小梁所體現的骨組織成分都表現處萎縮、減少；此種變化與中醫理論中的“骨痿”相符合。骨痹止痛丸組膝關節軟骨層增厚，表面光滑連續；相比腎陽虛組有效增加軟骨層中軟骨細胞數量，增加軟骨基質和同源軟骨細胞數目；軟骨層下骨小梁成分增寬，分布數量增加。見圖2。

注：A 對照組；B腎陽虛組；C 骨痹止痛丸組。

2.4 各組大鼠軟骨相關基因表達情況

與對照組相比，腎陽虛組的Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因表達水平明顯下調(P<0.05)。經骨痹止痛丸給藥治療后，以上基因表達水平明顯上調(P<0.05)。這些基因為軟骨祖細胞標志物和生長板軟骨細胞標志物。將各基因表達的相對差別倍數歸一化到內控基因Gapdh，見表4。

表4 基因相對表達量的影響

3 討論

中醫腎主骨理論源自于《內經》[7-8]。在中醫理論體系中，腎為先天之本，五行屬性為水，為陰中之陽。腎主藏精，包括稟受于父母的先天之精和水谷精微充養的后天之精，二者相互為用，彼此依存。《素問·陰陽應象大論篇》：“腎生骨髓”，髓藏于骨腔之中，以充養骨骼，構成腎主骨的物質基礎。國醫大師劉柏齡教授崇尚腎主骨的思想，并結合其自身多年臨床經驗總結確立了“治腎亦即治骨”的學術理念。他認為腎中精氣的保養，是人體抵御病邪和防治骨病的重要措施，這與現代醫學研究結果不謀而合。本研究中所使用的骨痹止痛丸具有補腎健骨，舒筋通絡的功效。腎主骨、生髓，腎虛則骨痿。無論是先天不足還是腎精的后天衰敗、房勞傷腎、他病及腎等都可以引起腎病及骨。所以在治療骨相關疾病時，善用補腎藥尤為重要。

現代醫學認為腎臟與骨骼組織具有相同的起源，均由中胚層細胞分化并發育而來，預示著腎臟與骨骼在人體的生長發育及受到損傷后的修復過程中可能存在著密切關系。腎臟可以產生骨形成蛋白7、促紅細胞生成素等物質，它們可以調節鈣磷代謝的平衡及成骨過程中有機質的形成和礦化等環節。同時，有研究發現腎臟通過調節骨保護素和硬骨素的水平，進而影響骨細胞的活性。上述物質在骨的形成、構建、功能維持以及損傷和修復過程中發揮了重要的作用。這些科學研究[9-12]為中醫學腎主骨理論提供了必要的科學依據和物質基礎。腎通過影響激素的產生和分泌，對骨產生直接或間接的調控作用。如下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸、下丘腦—垂體—性腺軸和下丘腦—垂體—甲狀腺軸，腎虛可導致以上3個靶腺軸的功能紊亂，造成垂體、性腺、甲狀腺等多個腺體的退行性改變，腺體分泌激素處于異常狀態，致使成骨功能下降。有研究表明受下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸系統調控的內源性糖皮質激素通過直接影響成熟成骨細胞Wnt蛋白的表達和分泌，可以間接抑制骨髓間充質干細胞向軟骨細胞的分化，并會促使成骨細胞形成[13]。

本研究建立了腎陽虛大鼠模型，研究發現腎陽虛組大鼠相比于對照組，血清中ACTH、T、LH、CORT等激素水平明顯下降，同時腎陽虛組腎臟病理切片表現為腎小球擴張，近曲小管變性，遠曲小管擴張。這提示在腎陽虛狀態下，大鼠的腎臟功能受到抑制和損傷。而通過骨痹止痛丸給藥治療，這種抑制和損傷在一定程度上得到了改善。在腎主骨的研究中，軟骨是不可割舍的重要部分。本課題組分析了一些軟骨相關的重要標志基因。腎陽虛組較對照組Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因表達明顯下調，而經骨痹止痛丸給藥治療后，這些基因相比腎陽虛組表達水平明顯上調。Sox9是一種主轉錄因子，通過調控靶基因Sox8、Sox5、Sox4、Acan、Col2a1、Col9a1、Col11a1、Hapln1和Wwp2在軟骨發育過程中發揮重要作用[14-16]。此前，本課題組利用轉錄組測序、同位素標記相對和絕對定量等現代生物學技術，對骨和軟骨發育、生長和再生相關的分子機制進行了探索，并證明其潛在的分子機制與腎主骨理論高度一致。本項研究的結果也與本課題組之前的研究結果一致[1-4]。這些結果提示骨痹止痛丸能夠有效改善大鼠腎陽虛的病理狀態，并通過調控Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因，從而達到保護軟骨的效果。

在前期的臨床研究[17]中，骨痹止痛丸已經顯示出其針對骨性關節炎等退行性疾病的確切療效，但其具體作用機制尚未完全清楚。本研究以腎主骨理論為切入點探討骨痹止痛丸調控腎陽虛大鼠軟骨的作用機制，發現骨痹止痛丸可通過提高軟骨標志物的基因表達水平發揮治療作用。關于中醫藥復方的研究，傳統的研究方法主要是通過單一的信號通路進行評估，無法系統而全面地揭示中藥復方治療疾病的科學內涵，這也是本研究需要繼續完善之處。中醫學提倡整體觀，如何從整體觀念出發，系統而全面地闡釋其科學內涵也是未來研究的新方向。在隨后的研究中，本課題組將繼續圍繞“腎主骨”這一方向，嘗試從轉錄組學、蛋白組學以及多組學聯合等角度，對其進行更深層次的研究和挖掘。