艾灸對癌性疲勞小鼠JAK-STAT信號通路的影響

李丹 胡凱文 韓麗 趙百孝

癌因性疲勞(Cancer related fatigue，CRF)是一種由腫瘤或者腫瘤治療引起的與患者體力不成正比，不能通過休息緩解的慢性主觀性疲勞。研究表明，在積極治療階段，30%～60%癌癥患者會經歷中度或重度疲勞，而在治療后一年內30%的患者會經歷重度疲勞，在治療十年后仍有20%患者遺留重度疲勞[1-3]。目前CRF的治療主要針對貧血、睡眠障礙等的中西藥治療和運動、行為、心理社會干預，尚無確切療效的藥物緩解這一現狀[4]。CRF的發病機制尚不明確[5]，炎癥假說認為長期存在的炎癥環境，特別是如白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-1，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎性細胞因子可誘導機體發熱，在CRF中發揮關鍵作用[6-7]。而IL-6等細胞因子可激活Janus激酶—信號傳導子和轉錄激活子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)信號通路從而加重炎癥反應或促進腫瘤的生成導致CRF的惡化[8]。前期研究表明，艾灸可降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子以改善癌性疲勞的狀態[9-11]。為了進一步發掘艾灸治療CRF的作用因素及內在機制，本研究通過觀察艾灸及同波長紅外線對CRF模型小鼠疲勞跑臺實驗及懸尾實驗等行為學、炎性因子及JAK-STAT信號通路上相關指標的影響，探究艾灸的作用機制及靶點，以期為CRF的中醫藥防治方案提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

SPF級7周齡雌性Balb/c小鼠：體質量(20～30) g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，SPF/VAF級。許可證號：SCXK(京)2016-0006。所有小鼠飼養于SPF級動物室，室溫20～25℃，相對濕度60%～80%，保持通風，定時換氣，每日光照12小時。4T1小鼠乳腺癌細胞：由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。本實驗經北京中醫藥大學倫理委員會批準(編號：BUCM-2021031104-1071)。

1.2 試劑與儀器

Total RNA Extraction Kit(批號：GPQ1801，GenePool)；mRNA/lncRNA qPCR Kit (批號：GPQ1808，GenePool)；Jak1 antibody(批號：133666，CST)；Phospho-Jak1 antibody(批號：bs-3238R，Bioss)；STAT3 antibody(批號：ab31370，Abcam)；Phospho-STAT3 antibody(批號：ab76315，Abcam)；Actin antibody(批號：ab6276，Abcam)；艾條(16 mm×130 mm，北京國醫研醫藥技術開發有限公司)。

超凈工作臺FLC-3型(哈爾濱市東聯)；離心機Centrifuge 5415D(Eppendorf)；熒光定量PCR儀9600Plus型(中國Bioer Technology)；溫控搖床TS-2000A(中國其林貝爾)；電泳儀PP-1150(中國CAVOY)；紅外陶瓷/石墨烯智能灸療儀BXM-02型(北京德源博匯科技有限公司)。

1.3 細胞培養、分組、造模及干預

4T1小鼠乳腺癌細胞，用含10%胎牛血清，100 U/mL青/鏈霉素的DMEM培養液，置于37 ℃，5%CO2培養箱中飽和濕度下進行培養，細胞呈貼壁生長，2～3天換液傳代，選取對數生長期的細胞進行實驗。

待小鼠適應性喂養3天后，隨機將其分為空白組、模型組、艾灸組、紅外組。除空白外，參照歐陽明子等[12]方法，選擇1×107個/mL 4T1乳腺癌細胞懸液于小鼠左腋下種植0.1 mL，一周后等到腫瘤大小達到50～100 mm3后，向小鼠腹腔注射順鉑(5 mg/kg)一次，復制CRF小鼠模型。

根據預實驗結果，并按人與動物等效劑量換算法，分別算得艾灸干預劑量、時間及頻率，即艾灸組在模型組基礎上艾灸關元穴；紅外組在小鼠關元穴距離5 cm處垂直發射紅外光源，輸出功率8 W, 紅外波長3.9 μm, 輻照面積12.5 cm2進行干預治療，兩組每次干預20分鐘，1次/日，一周6次，干預4周。

1.4 行為學檢測

1.4.1 疲勞跑臺實驗 干預完24小時，采用YLS-10B小鼠轉輪式疲勞儀研究各組小鼠間疲勞狀態，記錄小鼠每次實驗的奔跑時間、奔跑距離及電擊次數。

1.4.2 懸尾實驗 將小鼠尾部后1/3處用膠帶懸掛于支架上，頭部距離臺面15 cm，計時6分鐘，觀察小鼠后四分鐘(3～6分鐘)的不動時間進行統計。

1.5 組織取材

各組小鼠行為學檢測后立即取材。2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，摘除眼球取血，置于干凈的EP管中，室溫靜置2小時，3500 r/分鐘離心15分鐘，取血清置-80℃冰箱保存備用。剝離瘤塊，勻漿保存于-80 ℃冰箱備用檢測。

1.6 指標檢測

1.6.1 血清學指標 采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清IL-6、TNF-α相關炎性因子濃度。按照試劑盒說明書操作，分別設置不同濃度標準品孔、空白孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，37℃恒溫箱溫育60分鐘，棄去液體，重復洗版5次，加入底物，37℃避光孵育15分鐘，各孔加入終止液，15分鐘內在450 nm 波長處測定各孔的吸光度，通過標準品直線回歸計算出濃度相對值。

1.6.2 實時熒光定量PCR法檢測Jak1、STAT3及IL-6 mRNA表達 按Total RNA Extraction Kit(DNaseⅠ)試劑盒說明提取腫瘤細胞樣本中總RNA并定量，1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA的完整性。按mRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，-20℃保存備用。按mRNA/lncRNA qPCR Kit試劑盒說明進行擴增，反應程序為95℃ 30秒，(95℃ 5秒，60℃ 30秒)×45個循環，同時在60～95℃進行融解曲線分析，采用2-△△CT法進行數據的相對表達強度，所有樣本均設6個重復。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.3 Western blot法檢測Jak1、Phospho-Jak1、STAT3、Phospho-STAT3蛋白表達 按Protein Extraction Kit(GenePool/GPP1815)試劑盒說明進行瘤體組織BCA法蛋白定量，依照電泳上樣量需要用SDS-PAGE Loading Buffer(5×)調整蛋白濃度，100℃煮沸變性10分鐘備用。配制12%的分離膠，5%濃縮膠。算得待檢測蛋白樣品上樣量，濃縮膠恒壓80V，約20分鐘；分離膠恒壓120V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。2小時恒流300mA轉膜至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1小時。將PVDF膜置于雜交袋中，分別加入配制好的一抗4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘，加入相應二抗，室溫孵育1小時。TBST緩沖液洗膜3次，每次10分鐘。按ECL Plus Western Blot Kit試劑盒說明暗室中曝光，顯影并定影。條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進行讀取，除以內參Actin灰度值，即得樣品中目標蛋白的相對表達量，所有樣本均設6個重復。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 Balb/c小鼠行為學檢測

Balb/c小鼠干預4周后通過檢測疲勞跑臺實驗和懸尾實驗驗證機體和精神兩方面疲勞，如下表所示，與空白組相比，模型組小鼠跑臺時間、距離均顯著降低(P<0.01)，電擊次數和懸尾不動時間顯著增加(P<0.01)，證明癌性疲勞小鼠模型復制成功。與模型組比較，艾灸組、紅外組均增加了小鼠的跑臺時間、距離(P<0.05)，降低了小鼠跑臺的電擊次數和懸尾不動時間(P<0.05)。與紅外組比較，艾灸組小鼠的跑臺疲勞時間、距離有增加趨勢，電擊次數減少(P>0.05)，懸尾不動時間減少(P<0.05)，說明模型組造模成功，艾灸及紅外治療能緩解CRF小鼠的疲勞狀態。見表2、3。

表2 各組小鼠疲勞跑臺實驗結果比較

表3 各組小鼠懸尾實驗結果比較分鐘)

2.2 ELISA法檢測IL-6、TNF-α含量

如下圖所示，ELISA 提示小鼠血清中IL-6及TNF-α 含量較空白組顯著上升，組間差異有統計學意義(P<0.01)；經艾灸及紅外灸療儀干預治療后小鼠血清中IL-6及TNF-α含量減少，組間差異有統計學意義(P<0.05)；與紅外組比較，艾灸組小鼠血清中IL-6及TNF-α含量降低，組間差異有統計學意義(P<0.05)，說明艾灸及紅外照射治療能改善CRF小鼠的炎癥狀態。見表4。

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

2.3 RT-PCR法檢測Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA表達

小鼠經艾灸及紅外灸療儀干預后小鼠腫瘤組織中的Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA表達減少，組間差異有統計學意義(P<0.05)；與紅外組比較，艾灸組小鼠瘤體組織的Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA降低，組間差異有統計學意義(P<0.05)，說明艾灸及紅外照射治療能下調CRF小鼠的Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6m RNA的表達，激活JAK-STAT信號通路。見表5。

表5 各組小鼠瘤體組織JAK1、STAT3、IL-6 mRNA表達水平比較

2.4 Westernblot法檢測Jak1、Phospho-Jak1、STAT3、Phospho-STAT3蛋白的表達

艾灸組小鼠腫瘤組織P-Jak1與P-STAT3表達較模型組降低，組間差異有統計學意義(P<0.05)；紅外組小鼠腫瘤組織P-Jak1與P-STAT3表達較模型組降低，組間差異有統計學意義(P<0.05)；說明艾灸及紅外治療能下調P-Jak1與P-STAT3蛋白的表達。圖1、表6。

表6 各組小鼠瘤體組織P-Jak1/JAK1、P-STAT3/STAT3蛋白表達水平比較

圖1 Jak1、Phospho-Jak1、STAT3、Phospho-STAT3蛋白條帶圖

3 討論

癌性疲勞隸屬中醫理論中“虛證”和“虛勞”范疇, 《黃帝內經》曰“虛者補之、陷下則灸之”，說明艾灸療法可以較好地改善虛勞下陷等病癥。現代研究揭示，劉曉榮[13]、霍雨佳等[14]根據《素問·陰陽應象大論篇》中所闡述的“形不足者，溫之以氣”及李東垣的“脾主五臟元氣”的理論，觀察艾灸神闕、關元、氣海、中脘、足三里對CRF的影響，發現艾灸能夠改善癌癥患者的疲乏癥狀及生活質量。

JAK-STAT通路是一條參與細胞生長、發育、凋亡的重要細胞因子信號通路[15]，該通路的異常活化被證明在腫瘤細胞的克隆性增殖和分化中發揮了重要作用[16]。JAK是一類非特異受體型酪氨酸激酶，主要包含四個亞型，分別為JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，并能被包括IL-6在內的多種炎癥介質和細胞因子活化，繼而激活JAK-STAT信號通路，參與到多種疾病的發生發展[8]。白細胞介素6(interleukin6，IL-6) 是一種多功能細胞因子，在炎癥反應網中占有重要地位。IL-6與其受體結合后可通過3條信號通路發揮生物學功能：JAK/STAT途徑、Ras/Erk途徑和PI3K介導的途徑[17-19]。IL-6與IL-6Rα和gp130兩個受體結合后，通過磷酸化JAK而激活STAT3轉錄因子，磷酸化的STAT3形成二聚體，轉移至細胞核中，使JAK/STAT3信號通路持續激活而引起腫瘤組織的增長[17，20-21]。IL-6在癌癥患者中表達增高，而JAK-STAT通路參與了IL-6介導的免疫細胞炎癥反應，表明炎癥因子IL-6與JAK-STAT通路可能與促進腫瘤或者癌性疲勞機制有關[22-23]。另外，研究表明，TNF-α、IL-6能抑制促紅細胞生成素，減少血紅蛋白的產生及活動耐受力，亦能導致癌性發熱，使機體長期處于消耗性狀態，在CRF的發生過程中起關鍵作用[24-25]。

艾灸能直接激活JAK/STAT3信號通路調節炎癥狀態。楊馨等[26-27]通過干預滑膜細胞內JAK-STAT信號通路及分泌功能，證明艾灸能有效改善動物RA滑膜炎癥。趙繼夢等[28]運用隔藥灸抑制了NF-κB通路和STAT3的磷酸化, 減少了IL-6、IL-1β的釋放，從而緩解了腸炎模型大鼠的結腸炎癥。斐建等[29]發現艾灸可通過JAK-STAT3信號通路調節腫瘤微環境。

本研究中，CRF模型小鼠通過疲勞跑臺實驗和懸尾實驗兩方面反映了荷瘤小鼠的疲勞狀況。如結果所示，各實驗組疲勞度由高到低依次為：模型組、紅外組、艾灸組、空白組，證明癌性疲勞小鼠模型復制成功，艾灸及紅外灸療儀均能有效緩解CRF小鼠的疲勞狀態，艾灸治療作用更顯著。炎癥因子作為癌性疲勞的發病機制假說之一，本實驗示，與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α的含量明顯升高，同國內外研究結果一致。與模型組比較，紅外組、艾灸組均有效緩解了CRF鼠的炎癥狀態。在探究艾灸及紅外光治療癌性疲勞的作用機理中，JAK-STAT信號通路的各效應分子的表達也受到不同程度影響。其中, 與模型組比較，紅外組與艾灸組可明顯降低CRF小鼠P-JAK1、P-STAT3蛋白表達，IL-6、JAK1及STAT3mRNA的表達，提示艾灸及紅外灸可通過不同程度下調JAK-STAT信號通路，調節炎癥因子，起到抗癌性疲勞的作用。此外，與紅外組比較，艾灸組明顯降低了血清中IL-6、TNF-α的含量，減少了Jak1 mRNA、STAT3 mRNA及IL-6 mRNA的表達，P-JAK1、P-STAT3的蛋白表達上有降低的趨勢，說明艾灸組對JAK-STAT信號通路的影響上優于紅外組，填補了國際上觀察傳統艾灸與紅外灸對CRF療效比較及相關機制的空白，也進一步揭示了艾灸的作用機理。

總之，IL-6介導的JAK-STAT信號通路相關的炎癥反應在CRF的發生與進展中起重要作用。本研究表明，艾灸可不程度降低荷瘤及順鉑導致的癌性疲勞，其中紅外光發揮了關鍵作用，其機制可能是通過下調IL-6、TNF-α及JAK-STAT信號通路的表達發揮作用，該研究結果可為艾灸治療CRF提供一定科學依據。