乳制品中A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白含量的測定

袁兆豐，楊秀梅，王 丹

北大荒完達山乳業股份有限公司，黑龍江哈爾濱150000

0 引言

牛乳中主要包含酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白和乳鐵蛋白等。其中酪蛋白是乳蛋白的主要存在形式，占乳蛋白總量的80%，含有人體必需的8 中氨基酸[1]；β-酪蛋白是一種主要的酪蛋白，由209 個氨基酸殘基組成，磷酸化前的一級結構分子質量為23.6 kDa[2]，占牛乳蛋白總量的24%～28%[3]。

A2β-酪蛋白是現代奶牛β-酪蛋白的天然原型。早期所有家養奶牛只含有A2β-酪蛋白，后因自然基因突變，出現了A1β-酪蛋白的變體，經過長期的繁衍，導致全球奶牛普遍出現了A1 型奶牛、A1A2型奶牛和A2型奶牛。A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的蛋白質結構區別主要是第67位的氨基酸不同[4]，A1 β-酪蛋白是組氨酸，分子量155 Da，A2β-酪蛋白是脯氨酸，分子量115.13 Da。A1 β-酪蛋白和 A2 β-酪蛋白的分子量相差39.87 Da，占β-酪蛋白分子量23.6 kDa的0.17 %。A1 β-酪蛋白和 A2 β-酪蛋白的質量分數相差非常小，不到千分之二。

通過消化酶的作用，A1β-酪蛋白可能產生β-酪啡肽-7（BCM-7），而A2β-酪蛋白不會產出或很少產出β-酪啡肽-7（BCM-7）[5]。BCM-7是一種外啡肽，可與機體多種系統相互作用。多項研究表明，A1β-酪蛋白或BCM-7與部分嬰兒的I型糖尿病風險升高[6]，免疫反應功能性障礙、消化功能紊亂、呼吸功能障礙以及易得自閉癥之間存在關聯[7]。另有研究表明，A2β-酪蛋白不僅不會生成BCM-7，而且與母乳中的β-酪蛋白相似，更有利于促進嬰幼兒的生長發育。

本試驗在原有檢測方法的基礎上，只改變柱溫和梯度洗脫中部分時間段的流動相比例，使A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白能夠更好的分離，為牛乳中A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的進一步研究和嬰幼兒配方乳粉開發提供參考。

1 原理與方法流程

1.1 原理

乳及其制品加水溶解后，吸取1 mL液態樣品加入一定量的蛋白質變性劑鹽酸胍和還原劑二硫蘇糖醇等化學藥品，經前處理后高速低溫離心，離心結束后取出離心管，快速除去表層乳脂，取下清液加入鹽酸胍溶液后過濾膜上機檢測，在柱溫50 ℃條件下，使用0.1 %三氟乙酸溶液和乙腈，通過梯度洗脫分離上機樣液中的A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白，高效液相紫外色譜儀214 nm波長下檢測，外標法定量。

1.2 步驟

1．2．1 試劑耗材

乙腈（C2H3N）（色譜純），三氟乙酸（色譜純），雙-三羥甲基氨基甲烷（分析純），鹽酸胍（分析純），檸檬酸鈉（分析純），二硫蘇糖醇（分析純），β-酪蛋白（β-Casein，CAS號：9000-71-9），純度≥98 %，C8色譜柱，4.6 mm×150 mm，3.6 μm。

1．2．2 試劑配制

試劑I：分別稱取雙-三羥甲基氨基甲烷0.2092 g，鹽酸胍5.7318 g，檸檬酸鈉0.0139 g，二硫蘇糖醇0.0301 g，加0.1%三氟乙酸溶液5 mL，充分溶解后定容10.0 mL，混勻得雙-三羥甲基氨基甲烷0.1 mol/L，鹽酸胍6 mol/L，檸檬酸鈉5.37 mmol/L，二硫蘇糖醇19.5 mmol/L混合溶液。

試劑II：稱取鹽酸胍4.2989 g，加0.1 %三氟乙酸溶液5.00 mL充分溶解后定容10.0 mL，混勻得4.5 mol/L鹽酸胍溶液。

流動相A 0.1 %三氟乙酸水溶液：吸取1.00 mL三氟乙酸于1 000 mL容量瓶中，水定容，混勻；流動相B純乙腈。

β-酪蛋白標準溶液配制：將大塊的β-酪蛋白標準物質分成小片絮狀后放入25 mL小燒杯，在使用注射器加水時有助于更好的溶解，水平晃動燒杯，不可渦漩，防止泡沫產生[8]，溶解后轉移到25 mL容量瓶用超純水定容，混勻后1.0 mL分裝在1.5 mL離心管中，-20 ℃保存，現用現取，避免反復融化冷凍，可穩定保存3 個月。

1．2．3 試樣處理

稱取1 g固體試樣，溫水溶解，冷卻后定容10 mL，混勻。

液體奶試樣不用稀釋，吸取液態樣品1.00 mL轉入2.00 mL離心管中，向2.00 mL離心管中加入1 mL試劑I振蕩混勻后，靜置1 h，轉速6 000 r/min、4 ℃離心10 min，離心結束后取出離心管，快速除去表層乳脂，取底層溶液300.0 μL轉移到新的2.00 mL離心管中，加入試劑II 900.0 μL，混勻，過針式濾膜上機備用。

1．2．4 檢測條件

檢測波長214 nm，柱溫50 ℃，流動相A （0.1 %三氟乙酸水溶液），流動相B（乙腈），梯度洗脫條件如表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3 線性相關

配制β-酪蛋白系列標準工作液，5 個濃度點3 個平行上機檢測，以各濃度為橫坐標，各濃度峰面積平均值為縱坐標繪制線性方程。

1.4 正確度、精密度

β-酪蛋白含量做低、中、高三水平加標回收試驗，各濃度水平6 個平行，按試樣處理方法處理加標樣品，計算加標回收率。

1.5 結果計算

A2β-酪蛋白和 A1β-酪蛋白的質量分數相差非常小，不到千分之二，其性質非常接近，兩目標峰比較接近（圖1），A1β-酪蛋白濃度占比與A1 β-酪蛋白峰面積占比相當，A2β-酪蛋白濃度占比與A2β-酪蛋白峰面積占比相當。β-酪蛋白的主要成分為A1型和A2型，通過面積歸一化法，A1β-酪蛋白和 A2β-酪蛋白峰面積和為總峰面積，A1β-酪蛋白峰面積占總峰面積百分比w1，A2β-酪蛋白峰面積占總峰面積百分比w2。計算公式見公式（1），公式（2）。

圖1 β 酪蛋白標準物質在不同檢測條件下的峰型比較

計算公式：

公式（1）、（2）中：

w1----A1 β-酪蛋白濃度修正系數，單位百分比（%）；

w2----A2 β-酪蛋白濃度修正系數，單位百分比（%）；

i----標準曲線的中第i個濃度級別，（i取1、2、3、···、n）；

n----標準曲線中濃度級別的個數，（n取1、2、3、···、n）；

Sa----積分得A1 β-酪蛋白峰面積；

Sb----積分得A2 β-酪蛋白峰面積；

Σ----求和函數符號，i從1開始到n取整數。

標準系列工作液β-酪蛋白濃度為A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白濃度的和。則A1β-酪蛋白濃度占比為w1，A2β-酪蛋白濃度占比為w2，β-酪蛋白標準系列工作液各濃度點的w1、w2取平均值分別作為A1 β-酪蛋白和 A2β-酪蛋白的修正系數。

通過標準系列工作液β-酪蛋白濃度計算的A1 β-酪蛋白與A2β-酪蛋白在乘以各自的修正系數后，即為樣品中檢測的A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白濃度，根據稱樣質量，定容體積計算樣品中A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白的含量。計算公式見公式（3）。

公式（3）中：

X----試樣中A1β-酪蛋(A2β-酪蛋白)含量，單位毫克每克（mg/g）；

c----由標準曲線得到的試樣溶液中β-酪蛋白的濃度，單位毫克每毫升（mg/mL）；

V----試樣定容體積，單位毫升（mL）；

f----稀釋倍數；

V1----液態試樣取樣體積，單位毫升（mL）

V2----加入試劑I的體積，單位毫升（mL）；

V3----樣液離心后提取澄清液的體積，單位毫升（mL）；

V4----加入試劑II的體積，單位毫升（mL）；

w----試樣中A1 β-酪蛋（A2 β-酪蛋白）濃度修正系數，單位%；

m----樣品的稱樣質量，單位克（g）。

2 檢測結果分析

2.1 不同檢測條件的檢測結果比較

相同條件下，只改變柱溫和部分時間段的流動相比例，柱溫45 ℃，A流動相占比：12 min時59 %、15 min時61.5 %（圖1紅色線圖譜）；柱溫50 ℃，A流動相占比：12 min時60 %、15 min時58.5 %（圖1黑色線圖譜），梯度洗脫中改變乙腈的變化趨勢，提高柱溫，能夠更好的分離A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白。

2.1 線性關系

使用β酪蛋白標準儲備液配制標準工作液，流動相B（乙腈），A（0.1 %三氟乙酸水溶液），流速0.5 mL/min梯度洗脫，柱溫50 ℃，反相色譜柱進行分離，紫外檢測器214 nm檢測。A1 β-酪蛋白與A2 β-酪蛋白的出峰時間穩定（圖2），回歸方程：A1 β-酪蛋白，y=1.25×106x-1.44×105，R2=0.9985，R=0.9992；A2 β-酪蛋白y=3.16×106x-3.16×105，R2=0.9988，R=0.9994。A1 β-酪蛋白在0.16～1.65 mg/mL和A2 β-酪蛋白在0.34～3.35 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

圖2、 A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白各濃度點標準工作液

2.2 精密度、正確度

對奶樣做三水平加標回收試驗，A1β-酪蛋白精密度小于2.0 %，回收率范圍96.4%～105.0%；A 2 β-酪蛋白精密度小于2.0 %，回收率范圍97.5%～105.0%。圖3為β-酪蛋白標準物質和奶樣中A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。

圖3 β-酪蛋白標準物質與奶樣中A1 β-酪蛋白和A2 β-酪蛋白的峰型及出峰時間比對

3 結論

奶樣經前處理后，在低溫離心機離心后，吸取下層的酪蛋白，經稀釋后上機檢測。在柱溫50 ℃時，梯度洗脫條件下，在4.6 mm×150 mm，3.6 μm的C8色譜柱中，A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白能夠有效的分離，通過β-酪蛋白標準物質定量，再通過A1β-酪蛋白與A2β-酪蛋白修正系數，對A1 β-酪蛋白與A2β-酪蛋白的含量做修正計算。通過分析檢測結果，說明檢測方法線性關系良好，具有較好的精密度和正確度，可以對乳制品中的A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白做定量分析，具有較高的穩定新。C