乳制品檢驗液相色譜分析方法的建立與優(yōu)化

陳柏錫，孫嘉昊，劉 威，張文琪，吳曉輝

青島新希望琴牌乳業(yè)有限公司，山東青島 266000

0 引言

隨著我國經(jīng)濟水平的快速增長和國民購買力的普遍提高，以乳制品為首的健康食品產(chǎn)業(yè)正在蓬勃發(fā)展，乳制品的產(chǎn)量、銷量、市場需求量和進口量均大幅上漲，與乳制品市場規(guī)模發(fā)展相伴而來的是對乳制品檢驗工作更加嚴格的要求，尤其是對乳制品中農(nóng)藥、獸藥殘留；食品添加劑以及違禁品的檢測更為嚴格。高效液相色譜法具有檢出限低，精度高，重復性好的特點，而且可實現(xiàn)操作的自動化，能夠在較短時間內進行數(shù)量眾多樣品的日常分析，所以在檢驗領域占有十分重要的地位[1]。而在液相色譜法中，反相色譜因其可調節(jié)參數(shù)多，試劑成本較低，污染較小，普適性較強等特性，被廣泛應用于食品檢測中。本文以反相色譜法為研究對象，詳細介紹了反相色譜方法的開發(fā)與優(yōu)化步驟，對可優(yōu)化的參數(shù)逐一列舉，對于食品檢測方法的開發(fā)具有一定的參考價值。

1 反相色譜方法的建立

要對某種或多種目標物質建立合適的分析方法，首先要收集目標物質的相關信息以及確認實驗室的儀器條件，從而篩選可行的分析方法。選取合適的色譜條件是必不可少的，如：流動相的種類、色譜柱型號、進樣量、柱溫、檢測器種類等，通過連續(xù)的實驗確定色譜條件后，還要根據(jù)具體的出峰情況對方法進行優(yōu)化以得到更好的檢測效果。根據(jù)流動相和固定相極性的不同，液相色譜可分為正相色譜和反相色譜，反相色譜用超純水做基礎溶劑，用極性弱于水的有機溶劑如甲醇、乙腈等做有機相[2]，由于反相色譜可以調節(jié)的參數(shù)更多，普適性也更強，所以本文以反相色譜法的建立與優(yōu)化為例，以供參考。

1.1 收集目標物信息

首先要確定待測目標的個數(shù)、種類、相對分子質量、分子結構和官能團種類、溶解度以及酸度系數(shù)（pKa）和濃度范圍。上述信息的收集對于方法選擇和建立是至關重要的。如果目標物數(shù)量過多則需要在方法建立之初考慮目標峰分離的問題，而待測物質的相對分子質量通常會影響色譜條件的選擇，一般分子量較大的目標物質，如蛋白質分子、核酸或一些聚合物通常需要使用大孔徑的色譜柱，分子量較小的化合物可以使用后文介紹的通用初始色譜條件。分子結構及官能團決定了檢測器的種類和波長的選擇，比如亞砜（S=O鍵）在210 nm具有較好的吸光度，而碘化物在280 nm處吸光度最大，如果能得到目標樣品的光譜圖，則能夠快速的得知檢測器的最佳波長。對于目標物質的溶解度需要進行簡單的分類，一般能溶于水相或甲醇、乙腈類有機溶劑的樣品，通常使用反相色譜法進行檢測，若樣品只能溶于正己烷等低極性的有機溶劑，則要考慮正相色譜或其他的分析方法。若目標樣品是弱酸、弱堿類的非中性化合物，需考慮在流動相中添加相應的緩沖鹽溶液調整其pH值。綜上所述，對于目標物質的研究越充分，信息收集的越完善，越利于后期方法的建立和優(yōu)化。

1.2 初始方法的建立

當確定該目標物質能夠使用反相色譜的方法進行分離時，需要一個初始色譜條件作為摸索和優(yōu)化檢測方法的開端。初始條件中流動相一般使用較高的有機溶劑比例，對樣品出峰的先后順序以及特點進行分析，再進行具體的色譜條件調節(jié)。經(jīng)過實驗，以下色譜條件作為初始色譜條件，普適性較好：選擇C18色譜柱（ODS柱），進樣體積20 μL，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測器波長根據(jù)目標物質官能團的不同進行具體的選擇，流動相選擇80%的甲醇或乙腈，運行時間調整為40～60 min，在初始條件下觀察出峰結果。由于初始色譜條件的流動相有機溶劑比例較高，所以出峰時間相對較快，多個目標峰聚集較為密集，若在初始條件下仍有目標物質未出峰，則要考慮溶劑強度更高的有機溶劑，如四氫呋喃、乙腈等。

1.3 流動相的選擇和調整

反相色譜的流動相通常由有機相與水溶液（緩沖液）組成，可以通過調節(jié)有機相的種類、比例以及調節(jié)流動相的pH值達到提高分離度、改善峰型、改善目標物保留值等目的，這是其他色譜方法所不具備的優(yōu)勢。當用初始色譜條件能夠檢測到目標物質出峰后，根據(jù)目標物質的出峰時間降低有機相的比例，直到目標物質出峰時間在一個合適的區(qū)間。改變有機溶劑的種類同樣可以改變目標物質的出峰時間，通常情況下有機溶劑的溶劑強度越大，洗脫能力越強，目標物質出峰速度越快。相同比例的有機相-水溶液的洗脫能力：四氫呋喃＞乙腈＞甲醇。某些弱酸或弱堿性物質在水溶液中會發(fā)生電離，導致目標物質在色譜柱上保留值很低甚至完全不保留，此時可以使用不同種類的緩沖鹽溶液來調節(jié)流動相的pH值，減少目標物質的電離。

通常在對上文給出的初始條件下分離得到的結果進行流動相參數(shù)調整時，宜按照以下步驟操作：先改變有機相的比例，如：將80%的甲醇水調整為65%甲醇水，當只改變有機相比例不足以滿足實驗要求時，應改變有機相的種類，如將甲醇替換成乙腈或四氫呋喃，或者將幾種有機溶劑按照一定比例進行混合。當調整了有機溶劑比例和種類后，目標物質仍然出現(xiàn)較低的保留值，則應考慮使用不同pH值的緩沖溶液，提高目標物質的保留值。磷酸緩沖液最常用的緩沖溶液，通過配制0.2 M磷酸二氫鈉溶液和0.2 M磷酸氫二鈉溶液，按照一定比例進行混合，可以配制出不同pH值的磷酸緩沖液。

2 反相色譜方法的優(yōu)化

在建立一個檢測方法之初，新的方法不可能是完善的，通常會出現(xiàn)如：分離度不滿足要求，回收率較低，出峰時間過早或過晚，噪聲信號過高影響方法檢出限等問題，所以對新建立的方法進行優(yōu)化和調整是必要的。

2.1 改善分離度

分離度是評價多個組分之間分離效果的重要指標，其數(shù)值等于兩峰頂點的間距與兩峰峰底寬之和比值的兩倍，即：兩峰的頂點間隔越遠，兩個峰寬度越窄、越尖銳，分離度越好。一般在優(yōu)化分離度時通常使用如下公式：

其中Rs為兩目標物之間的分離度，N為理論塔板數(shù)，α為兩峰保留值的比值，k為兩峰保留值之和的平均值。根據(jù)上述公式，要提高兩種目標物的分離度可以通過提高理論塔板數(shù)N來實現(xiàn)，比如使用更長的色譜柱通常會改善分離效果。通過調整流速也可以提高柱效，一般情況下低流速擁有更高的柱效，但流速不宜過低，一般在0.8～1.5 mL/min為佳。通過提高目標峰的保留值，也可以提高目標物之間的分離度，比如降低流動相中有機溶劑的比例、將有機溶劑更換為溶劑強度較弱的，如把乙腈換為甲醇等，但提高保留值或者使用較長色譜柱的同時，通常會使得出峰時間后延，所以要根據(jù)實驗的具體需要加以權衡。

2.2 優(yōu)化出峰時間

經(jīng)過前處理后的樣品中會含有少量的保留值較低的雜質，當目標物質的出峰時間過早時，有可能與雜質峰相互重疊，為了權衡出峰效果和工作效率，一般將出峰時間調整在10～30 min[3]。通過調整流速、有機相的比例等可以達到調整出峰時間的效果，通常有機溶劑的比例越高，出峰速度越快。在方法建立之初，可以根據(jù)實際的出峰效果，選擇更長或更短的色譜柱達到增加和縮短出峰時間。實驗中偶爾會發(fā)生出峰時間波動的現(xiàn)象，其原因有可能是色譜柱溫度范圍控制不當導致溫度波動太大所導致的，也可能是由于流動相未充分混勻導致組分發(fā)生變化產(chǎn)生的[4]，尤其是流動相添加了多種組分，如：離子對試劑、峰拖尾改善劑等，應注意搖勻后抽濾使用。

2.3 提高信噪比

信噪比（S/N）是目標物質信號與噪聲信號的比值，在液相色譜的圖譜中通常使用目標峰扣基線后的高度與基線寬度做比值。提高信噪比對于提高檢測精度和確定檢出限、定量限均具有重要意義[5]。提高信噪比要從提高目標信號或降低噪聲信號入手。提高目標信號可以通過：增加樣品濃度、增加進樣體積、選擇合適的檢測器波長等方法實現(xiàn)，但樣品濃度或進樣體積過大也會造成峰展寬、拖尾等現(xiàn)象，需通過實驗進行調節(jié)。噪聲信號主要是基線不平穩(wěn)抖動產(chǎn)生的，通常流動相或其他溶劑中的氣泡會導致基線的抖動，增加噪聲信號，流動相配制后經(jīng)過0.22 μm濾膜進行抽濾，配制流動相的試劑選擇色譜純或優(yōu)級純，配制完成后進行超聲排氣，在檢測時將沖洗閥擰松，用大流量進行排氣5～10 min，并使用儀器自帶的在線脫氣系統(tǒng)進一步將溶劑中的氣泡排出，可以保證基線平穩(wěn)[6]。當色譜柱被污染時，也會造成噪聲信號的提高，所以在檢測時安裝保護柱是必要的，當色譜柱被樣品污染時，可以使用高溶劑強度的試劑，如純甲醇或乙腈對色譜柱進行沖洗，在實驗結束后對色譜柱進行沖洗和純甲醇充滿色譜柱的操作也能夠避免樣品的污染。另外，柱溫箱溫度的波動和系統(tǒng)壓力的波動也會增加噪聲信號。

2.4 優(yōu)化系統(tǒng)壓力

當液相色譜系統(tǒng)中的流速固定時，理論上系統(tǒng)的壓力也是一定的，當系統(tǒng)的壓力不穩(wěn)定或出現(xiàn)壓力偏高或偏低時應考慮系統(tǒng)內部的異常[7]。正常液相色譜系統(tǒng)的壓力應在150 bar以下。流速過快會導致系統(tǒng)壓力的上升，通常流速在1.0～1.5 mL/min為最佳，不宜超過2.0 mL/min[8]。流動相的黏度也會影響系統(tǒng)的壓力，當系統(tǒng)壓力偏高時應考慮更換黏度更低的流動相，如將甲醇替換為乙腈等。當同一個檢測方法在參數(shù)未發(fā)生改變，但兩次檢測壓力差距過大時應考慮儀器內部設備是否出現(xiàn)堵塞的現(xiàn)象，如色譜柱堵塞、過濾白頭堵塞等。色譜柱所處的溫度對系統(tǒng)壓力也有一定的影響，通常柱溫越高，壓力越低[9]。

2.5 改善峰拖尾

峰拖尾是最常見的峰型異常情況，一般的峰拖尾會影響檢測結果的精度、柱間重復性等，而嚴重的峰拖尾會拖延至下一目標峰中，影響二者的分離度[10]。峰拖尾常出現(xiàn)在使用過度的色譜柱中，當色譜柱被強保留樣品污染時造成的峰拖尾可以使用強溶劑進行沖洗，沖洗順序為：純甲醇——異丙醇——二氯甲烷——異丙醇——純甲醇。必要時也可以用強溶劑低流速對色譜柱進行反沖。

峰拖尾也有可能是柱外效應導致的，尤其是當色譜系統(tǒng)的死體積較大時易出現(xiàn)拖尾。柱外效應導致的拖尾現(xiàn)象通常是先出的峰拖尾嚴重，越靠后的峰拖尾越輕的規(guī)律，可以采取減少儀器組件之間管路連接長度，使用體積較少的流通池以降低死體積，并注意樣品濃度和進樣體積，避免過載。目前越來越多的研究者用減小流動相 pH 值或者添加三乙胺等物質抑制硅羥基的解離，從而降低峰拖尾的現(xiàn)象[11]。

3 總結

無論是根據(jù)已有的液相色譜分析方法進行優(yōu)化，還是重新建立一個分析方法，都應該以最終的實驗結果為導向，并從前處理、色譜條件、分析過程與最終結果等多個方面綜合考量，在具體的實驗數(shù)據(jù)和圖譜當中找到可以優(yōu)化的點，并將其與具體的色譜條件結合起來，修正條件后重復實驗直到過程和結果均趨于穩(wěn)定。當改變某個色譜條件時通常會引起多個參數(shù)的改變，應在設計方法時加以權衡，找到最適合當前色譜條件的分析方法。C