紅參水煎液對(duì)心衰大鼠心功能及氧化應(yīng)激的影響*

溫 玉 胡琨建 李 歐 蔡曉月 趙英強(qiáng)△

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.貴州省貴陽(yáng)市第四人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300143）

紅參為五加科植物人參經(jīng)過(guò)蒸制后的干燥根及根莖，性味甘、微苦，溫，歸脾、肺、心經(jīng)，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、益氣攝血的功效[1]，相較于人參，紅參的溫陽(yáng)功效更佳。研究發(fā)現(xiàn)，紅參中的有效成分可通過(guò)多途徑改善心血管疾病[2-3]，聯(lián)合西藥在治療充血性心力衰竭方面發(fā)揮協(xié)同作用，且無(wú)明顯副作用[4]。本研究以腹主動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建心衰大鼠模型，探討紅參水煎液對(duì)心衰大鼠心功能及氧化應(yīng)激的影響，為紅參治療心衰提供一定的理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK（津）2019-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度20～24℃，相對(duì)濕度60%左右。

1.2 試劑與儀器 紅參來(lái)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，將240 g紅參加入純凈水中浸泡20 min，煎煮3次，每次煎煮時(shí)間分別為45、60、90 min，合并水煎劑，將藥物濃縮至1.2 L后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩o(wú)水乙醇、二甲苯、伊紅染液、蘇木素染液、鹽酸、氨水、PBS緩沖液、JYBL-Ⅱ脫鈣液、中性樹(shù)膠、活性氧（ROS）測(cè)定試劑盒（南京建成）、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒（碧云天）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（碧云天）、谷胱甘肽過(guò)氧化物（GSH）檢測(cè)試劑盒（碧云天）、大鼠N端前腦鈉肽（NT-proBNP）酶免試劑盒。小動(dòng)物超聲儀Vevo3100、-80℃低溫冰箱、全自動(dòng)生化分析儀Microlab300、脫水機(jī)、包埋機(jī)、病理切片機(jī)、凍臺(tái)、組織攤片機(jī)、烤箱、搖床、渦旋混合器、顯微鏡（OLYMPUS）。

1.3 分組與造模 將30只雄性SD大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為模型組與假手術(shù)組，其中模型組24只，假手術(shù)組6只。模型組按照文獻(xiàn)[5]中腹主動(dòng)脈縮窄的方法建立心衰模型，假手術(shù)組縫合線僅穿過(guò)腹主動(dòng)脈，未結(jié)扎。造模后，給大鼠連續(xù)3 d腹腔注射青霉素以預(yù)防感染。術(shù)后12周對(duì)大鼠進(jìn)行心功能檢測(cè)，以左室射血分?jǐn)?shù)（LEEF）≤50%作為造模成功的標(biāo)志。造模過(guò)程中模型組死亡4只大鼠，將剩余20只大鼠隨機(jī)分為模型組、紅參低劑量組、紅參中劑量組、紅參高劑量組，每組各5只。

1.4 給藥方法 紅參成人每日服用劑量為3～10 g，因此將低、中、高劑量組分別設(shè)定為2.5、5、10 g（每日成人量）。按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]計(jì)算大鼠與人體的等效劑量（以正常人體質(zhì)量為60 kg計(jì)算，大鼠的等效劑量是人體的6.25倍），低、中、高劑量組大鼠每日用量分別為0.26、0.52、1.04 g/kg。將制備好的紅參水煎液加純水按倍數(shù)依次稀釋為0.52、0.26 g/kg。紅參低、中、高劑量組大鼠每日分別給予0.26、0.52、1.04 g/kg紅參水煎液灌胃，模型組及假手術(shù)組每日給予相同體積的生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)8周。

1.5 心功能超聲檢測(cè) 在造模12周及灌胃結(jié)束后進(jìn)行心功能檢測(cè)。采用小動(dòng)物B超-Vevo3100記錄大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）。每只大鼠測(cè)3次心動(dòng)周期，取平均值。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 干預(yù)8周后，取材前1晚大鼠禁食水，腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫放置2 h后，在4℃下以3 500 r/min離心10 min，將上清分裝后置于-80℃冰箱。剪取大鼠全心組織，記錄全心質(zhì)量，將部分心肌組織固定于10%的甲醛溶液中，其余組織凍存于-80℃冰箱。1）血清NT-proBNP檢測(cè)。采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清NT-proBNP水平，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2）心肌組織HE染色。在取材后將心肌組織進(jìn)行病理檢測(cè)，按照脫蠟、脫水、染色、脫水、透明、封固的步驟對(duì)心肌組織進(jìn)行HE染色。3）心肌組織中ROS、SOD、MDA、GSH-Px的含量。ELISA法檢測(cè)肌組織中ROS、SOD、MDA、GSHPx的活性，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，對(duì)于不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心衰大鼠心動(dòng)超聲LVEF、LVFS的比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的LVEF、LVFS降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，紅參低、中、高劑量組的LVEF、LVFS均升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各治療組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組心衰大鼠心臟彩超LVEF、LVFS及血清NT-proBNP含量比較（±s）

表1 各組心衰大鼠心臟彩超LVEF、LVFS及血清NT-proBNP含量比較（±s）

注：與假手術(shù)相比，△P＜0.05；與模型組相比，▲P＜0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組紅參低劑量組紅參中劑量組紅參高劑量組n 6 5 5 5 5 LVEF（%）69.10±4.98 41.60±11.44△68.11±5.51▲61.15±6.51▲68.50±6.75▲LVFS（%）40.44±4.02 21.61±6.45△39.44±4.26▲34.27±5.06▲39.84±5.18▲NT-proBNP（pg/mL）193.85±36.54 290.84±36.39△287.70±76.73△272.43±60.83 237.24±5.70

2.2 各組心衰大鼠血清NT-proBNP含量比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清的NT-proBNP含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型相比，紅參低、中、高劑量組均降低，但各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組心衰大鼠心肌組織病理形態(tài)觀察 假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)正常，心肌細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)橫紋，組織間未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而模型組組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，心肌細(xì)胞排列疏松，可見(jiàn)橫紋，大量心肌細(xì)胞肥大，組織間可見(jiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。紅參各治療組整體情況較好，組織結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)橫紋，部分出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大，組織間未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中紅參高劑量組效果基本與假手術(shù)組接近，組織間僅有極少量肥大的心肌細(xì)胞。說(shuō)明紅參水煎劑明顯改善了心衰大鼠的心肌結(jié)構(gòu)，且紅參高劑量組效果較為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心衰大鼠心肌組織（HE染色，200倍）

2.4 各組心衰大鼠心肌組織ROS、SOD、MDA、GSHPx含量比較 見(jiàn)表2。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠ROS活性、MDA含量均升高，SOD、GSH-Px含量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，紅參低、中、高劑量組的ROS活性均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，紅參低、中、高劑量組的MDA含量均降低，其中紅參低劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，紅參低、中、高劑量組的SOD含量均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，紅參低、中、高劑量組的GSH-Px含量均升高，其中紅參高劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織ROS、MDA、SOD、GSH-Px比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織ROS、MDA、SOD、GSH-Px比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組紅參低劑量組紅參中劑量組紅參高劑量組n 6 5 5 5 5 ROS（%）80.14±6.78 123.51±2.93△103.14±16.38▲95.90±7.93▲89.96±2.27▲MDA（nmoL/g）130.07±161.10 409.12±290.26△142.12±71.28▲187.54±182.04 252.74±153.84 SOD（U/mg）0.82±0.34 0.31±0.08△0.63±0.21▲0.64±0.18▲0.69±0.25▲GSH-Px（U/mg）87.35±24.24 40.76±8.16△48.61±6.70 42.75±2.86 80.38±20.49▲

3 討 論

心力衰竭是各類(lèi)心血管疾病發(fā)展的最終階段，嚴(yán)重影響患者的身心健康。最新流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[7]，在我國(guó)慢性心衰的患病率為1.10%，且患病率隨著年齡增長(zhǎng)而增加。因此，積極選用防治心衰的藥物并研究其作用靶點(diǎn)顯得尤為重要。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心氣不足、心陽(yáng)虧虛是心衰的根本病機(jī)，血瘀、痰濁、水飲是主要的病理產(chǎn)物[8]，因此在治療上多以溫補(bǔ)心氣心陽(yáng)為主，在用藥上多注重補(bǔ)氣藥的運(yùn)用。人參是補(bǔ)氣之圣藥，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫的作用，對(duì)心氣虛導(dǎo)致的心衰療效明確。紅參作為人參的炮制品，在加工過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生如人參皂苷Rg3、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2、人參炔醇等多種成分，其抗氧化、抗衰老、抗凋亡的藥理功效得以加強(qiáng)[9]，對(duì)氣虛日久損及陽(yáng)氣而致的心衰效果更為顯著，但其機(jī)制尚未完全明確，為此本文以不同濃度的紅參水煎劑干預(yù)心衰大鼠，探討其對(duì)心衰大鼠心功能及氧化應(yīng)激的影響。

目前，NT-proBNP可用于心力衰竭的早期檢測(cè)，作為獨(dú)立的診斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于臨床[10-11]，而LVEF與LVFS是反映左心收縮功能的指標(biāo)，是臨床心臟結(jié)構(gòu)與功能評(píng)估的首選方法[12]，對(duì)于NT-proBNP、LVEF、LVFS的檢測(cè)可一定程度反映心衰大鼠的心功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的LVEF、LVFS顯著降低，而NT-proBNP含量升高，說(shuō)明與假手術(shù)組相比，模型組的心功能明顯降低。在連續(xù)給藥8周后，與模型組相比，紅參低、中、高劑量組大鼠的LVEF、LVFS均顯著升高，NT-proBNP含量也均有降低趨勢(shì)，但各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心肌組織的HE染色顯示，紅參水煎液可以改善心衰大鼠的心肌結(jié)構(gòu)。由此可見(jiàn)，紅參水煎液可改善心衰大鼠的心肌結(jié)構(gòu)，提高心功能，從而改善心衰。

近年研究表明，氧化應(yīng)激在心力衰竭中增加并影響疾病的進(jìn)展，是心衰的發(fā)病機(jī)制之一[13-14]，而ROS、SOD、MDA、GSH-Px均可反映機(jī)體的氧化與抗氧化能力[15-16]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠ROS活性、MDA含量均升高，SOD、GSH-Px含量均降低，說(shuō)明腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后大鼠氧自由基產(chǎn)生增加，抗氧化能力降低，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。經(jīng)過(guò)連續(xù)8周的用藥后，與模型組相比，紅參低、中、高劑量組的ROS活性均降低，MDA含量也有降低趨勢(shì)，而SOD含量均升高，GSH-Px含量均有升高趨勢(shì)。由此說(shuō)明，紅參水煎液可清除氧自由基，改善左心室的抗氧化能力，使氧化及抗氧化作用趨于平衡，從而改善心衰大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，紅參水煎液可以改善心衰大鼠的心功能，其機(jī)制可能與減少氧化應(yīng)激、改善抗氧化能力有關(guān)。本研究初步探討了紅參水煎液對(duì)心衰大鼠心功能的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為指導(dǎo)心衰的臨床治療有一定現(xiàn)實(shí)意義，但紅參水煎液降低氧化應(yīng)激的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。