基于Hippo-YAP信號通路探討桃紅四物湯對BMSCs增殖與成骨分化的影響*

周文佳 尚云峰 朱文新 楊 卓 盧雪笛 申 楠 向黎黎 陸小龍△ 熊 輝（.湖南省岳陽市中心醫(yī)院，湖南 岳陽 000；.湖南省常德市第一中醫(yī)院，湖南 常德5000；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 0005；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 0007）

骨折可通過手術(shù)或者復(fù)位后愈合，但仍有5%～10%的臨床患者在治療后出現(xiàn)骨不連[1]，不愈合引起的疼痛，肢體功能障礙和心理障礙給患者和家庭帶來的痛苦是巨大的，增加了家庭和社會的經(jīng)濟負擔(dān)[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療方法包括去除變硬的骨頭、清潔未連接的末端組織、切髓腔、固定或骨移植[3]，但對于萎縮性骨不連，治療效果卻不如人意。盡管在臨床中可以通過簡單的壓迫或藥物來促進骨折愈合，但其愈合機制仍不清楚。中醫(yī)藥在治療骨折方面具有獨特優(yōu)勢，以桃紅四物湯為代表的方劑在治療臨床骨不連及促進骨折愈合的方面療效顯著，但其內(nèi)在作用機制仍不夠明確。為了進一步探索骨折的不愈合和愈合的機制，許多學(xué)者在細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方面進行了相關(guān)研究，其中以骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）與Hippo-YAP信號通路兩個靶點最受關(guān)注。本研究從實驗角度進一步論證桃紅四物湯促進骨折愈合的分子機制，為其臨床應(yīng)用和潛在開發(fā)提供有價值的理論依據(jù)以及實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠10只，雌雄不拘，遠交系，清潔級，用于分離骨髓間充質(zhì)干細胞；Wistar大鼠共40只，雌雄各半，體質(zhì)量（250±10）g，用于含藥血清的制備；實驗動物均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 試藥與儀器 桃紅四物湯湯劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科提供，根據(jù)《醫(yī)宗金鑒》記載，并規(guī)范為現(xiàn)代超微顆粒藥物劑量，主要成分：桃仁20 g，紅花10 g，生地黃20 g，赤芍20 g，川芎10 g，當(dāng)歸20 g。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，多聚甲醛、胰蛋白酶購自上海寶曼公司，茜素紅、雙抗、CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒購自北京雷根公司，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、30%甲叉雙丙烯酰胺購自上海伊塔生物科技公司，Verteporfin購自上海雅吉生物科技，過硫酸銨、甘氨酸、枸櫞酸鈉、水合氯醛購自上海生工，PVDF膜、5%脫脂奶粉購自北京沃凱生物科技，RealBand蛋白預(yù)染Marker、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自蘇州新賽美，BeyoCoLorTM彩色預(yù)染蛋白、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液（強）、20×TBS緩沖液購自上海碧云天公司。桃紅四物湯含藥血清的制備：桃紅四物湯以0.3㎏大鼠的給藥劑量為0.36 g/d灌胃，對照組0.9%氯化鈉注射液等體積灌胃，制備血清滅活補體后，低溫冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）分離及培養(yǎng)：將實驗大鼠麻醉斷頸處死，95%酒精浸泡2 h，分離大腿股骨及脛骨，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗股和脛骨髓腔，收集沖洗液，補充含20%胎牛血清及1%鏈霉素。然后，將骨髓細胞懸液通過70 μm細胞過濾器過濾，通過300 r/min的離心機分離，會出現(xiàn)上層清液及下層沉淀物質(zhì)，取下層。加雙倍血清和雙抗，24 h后觀察細胞貼壁情況，棄掉未貼壁細胞懸液，將培養(yǎng)物保持在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。每2天更換1次培養(yǎng)基，直到細胞亞融合，融合程度達到80%及胰蛋白酶被消耗后，按照1∶2比例培養(yǎng)，傳代。將培養(yǎng)的第3代BMSCs用于實驗。

1.3 分組及干預(yù) 將所培養(yǎng)的BMSCs細胞置于含15%胎牛血清的DMEM/F12低糖培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)。用培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為1×106/L，細胞狀態(tài)良好時接種于96孔培養(yǎng)板。將96孔培養(yǎng)板上的細胞隨機分為3組，空白血清組、桃紅四物湯含藥血清組（THSWT組）、桃紅四物湯含藥血清+Verteporfin組（THSWT+V組）。各組細胞干預(yù)方法：待細胞融合2 d后，加入含藥血清開始進行干預(yù)?？瞻籽褰M：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培養(yǎng)基+空白血清進行培養(yǎng)。THSWT組：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培養(yǎng)基+桃紅四物湯含藥血清進行培養(yǎng)。THSWT+V組：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培養(yǎng)基+桃紅四物湯含藥血清+Verteporfin進行培養(yǎng)。

1.4 標本采集與檢測 1）細胞增殖活力檢測實驗（CCK-8實驗）：將BMSCs置于無血清DMEM培養(yǎng)皿中饑餓24 h，然后在含有1% FBS的正常DMEM培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，向孔板中加入定量CCK-8試劑溶液均勻，然后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到37℃、5% CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后檢測。在第0、1、3和7天通過CCK-8測定法分析BMSCs細胞增殖能力。2）堿性磷酸酶檢測實驗（ALP）：干預(yù)結(jié)束后，根據(jù)ALP試劑盒提供的方案進行ALP測定，比較使用不同方法干預(yù)BMSCs后的結(jié)果。3）茜素紅染色實驗：干預(yù)21 d后，將BMSCs置在培養(yǎng)皿中用緩沖液浸洗3次；4%多聚甲醛中固定30 min，緩沖液浸洗3次，茜素紅染色液染色20 min；染色完畢后沖洗，然后在光鏡下可觀察到橘紅色的鈣沉積陽性細胞，比較各組之間的差異。4）Western blotting實驗：提取BMSCs細胞蛋白并定量。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，將膜與一抗在4℃孵育過夜，然后二抗孵育，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測膜上的信號，并使用Image-J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行處理，所有數(shù)據(jù)以（）表示，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)檢驗并符合正態(tài)性，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用成組t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs免疫表型特征 見圖1。流式鑒定BMSCs免疫表型特征：CD44、CD29和 CD105陽性，CD34、CD45陰性，符合BMSCs細胞特征。

圖1 BMSCs免疫表型特征

2.2 CCK-8細胞增殖活力結(jié)果 見圖2。對比空白組含藥血清及桃紅四物湯含藥血清，后者干預(yù)下的BMSCs細胞增殖速度明顯增快（P＜0.01），當(dāng)我們使用Verteporfin阻斷Hippo信號通路后，發(fā)現(xiàn)BMSCs細胞的增殖速度明顯減慢（P＜0.01）。

圖2 各組BMSCs細胞增殖活力

2.3 ALP、茜素紅染色分析BMSCs骨向分化程度 見圖3。ALP檢測顯示：BMSCs的成骨分化程度顯著降低。使用Hippo通路阻斷劑Verteporfin后，茜素紅染色顯示鈣鹽沉積明顯減少。

圖3 各組BMSCs骨向分化

2.4 Western blotting實驗結(jié)果 見圖4，圖5。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入Hippo信號通路抑制劑后，成骨分化關(guān)鍵因子的蛋白表達明顯減低（P＜0.01），但其蛋白表達高于空白血清組（P＜0.01）。桃紅四物湯含藥血清干預(yù)與空白組含藥血清干預(yù)后的Hippo信號通路關(guān)鍵因子表達，結(jié)果顯示YAP蛋白表達降低，TAZ蛋白表達增高（P＜0.01）。

圖4 成骨因子蛋白表達

圖5 Hippo信號通路關(guān)鍵蛋白

3 討論

骨折是世界范圍內(nèi)重要公共衛(wèi)生問題，老年人口比例的激增，使得發(fā)病率和住院率進一步增加，由此產(chǎn)生昂貴的經(jīng)濟成本[4-5]。高齡人群骨折后愈合變得更加緩慢和困難，這種情況導(dǎo)致了許多骨折患者在經(jīng)歷了復(fù)雜型骨折或者骨折合并其他并發(fā)癥時，會出現(xiàn)骨缺損或者骨不連的癥狀[6-8]。嚴重的骨缺損及骨不連會導(dǎo)致局部肢體的萎縮和功能喪失，嚴重影響患者的正常生活，是造成早期殘疾的重要影響因素[9]。因此，我們越來越需要開發(fā)改善骨折愈合速度以預(yù)防骨缺損和骨不連的治療策略。

BMSCs是骨損傷細胞療法和組織工程中最常用的干細胞[10]。當(dāng)骨折發(fā)生時，骨髓間充質(zhì)干細胞遷移至骨病變并分化為成骨細胞，分泌大量細胞外基質(zhì)以促進骨折愈合，BMSCs的遷移和成骨分化受多種細胞信號等的調(diào)控，比如Hippo-YAP信號通路、Wnt通路、FAK通路等，提高BMSCs的成骨分化能力對于骨缺損和骨不連的治療至關(guān)重要[11]。

桃紅四物湯源自《醫(yī)宗金鑒》，全方由6味藥組成，皆為活血化瘀藥，桃仁及紅花化瘀行血，當(dāng)歸及川芎活血行血，輔之熟地黃、芍藥活血柔血。本課題組對桃紅四物湯開展了許多臨床及實驗研究，其中臨床研究結(jié)果表明：桃紅四物湯能促進早期及中期骨折的修復(fù)，并縮短骨折愈合時間，預(yù)防骨缺損和骨不連[12]。桃紅四物湯能在骨折的不同時間段維持VEGF蛋白的高表達，并且能促進骨痂微血管的新生，從而促進骨折的愈合[13]。研究表明：VEGF蛋白的表達增高可以通過其對肌動蛋白細胞骨架的作用激活YAP，激活YAP誘導(dǎo)一個轉(zhuǎn)錄程序來進一步控制細胞骨架動力學(xué)[14]。前期的實驗中也發(fā)現(xiàn)[15]：維持骨折斷端骨痂VEGF的高水平是桃紅四物湯促進骨折愈合的關(guān)鍵所在，也是促進BMSCs細胞遷徙、歸巢的重要條件。桃紅四物湯在促進VEGF表達的同時，同時也激活了Hippo-YAP信號通路。Hippo信號通路下游的YAP與TAZ共同激活RUNX2以驅(qū)動BMSCs的成骨細胞分化并抑制成脂過氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPAR）誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[16-18]。

Hippo信號通路在BMSCs成骨分化過程中十分重要，YAP及TAZ蛋白在下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄作用更是必不可少，我們的實驗發(fā)現(xiàn)，在桃紅四物湯含藥血清中加入Hippo信號通路阻斷劑Verteporfin后，相比較沒有使用Verteporfin桃紅四物湯含藥血清干預(yù)下的BMSCs，其增殖活力和成骨分化能力顯著下降，這說明桃紅四物湯在促進骨折愈合中BMSCs增殖和成骨分化的關(guān)鍵通路包含Hippo-YAP，Hippo-YAP信號通路介導(dǎo)了桃紅四物湯促進骨折早期愈合的過程，其影響主要在于BMSCs細胞的增殖和成骨分化。隨著細胞標記，檢測技術(shù)的進一步發(fā)展，希望我們能在未來的時間中進一步探尋桃紅四物湯對BMSCs的影響，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究添磚加瓦。