利用SSR創建中國北方黍稷資源DNA身份證

胡玉璐，姜百靈，陳 凌，王海崗，曹曉寧，王瑞云，喬治軍

（1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 農業基因資源研究中心/農業農村部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室/雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031）

黍稷，又名為黍（Panicum miliaceumL.），是我國傳統的糧食作物，抗旱能力極強，適宜栽種在干旱以及半干旱地區，在我國的北方尤其在西北地區非常適宜種植[1-3]。黍稷的栽種在我國旱作農業、鹽堿地的開發利用和救災補種中，發揮著十分重要的作用[4]。黍稷具有上萬年的栽培歷史，多篇歷史文獻資料曾記載黍稷栽種在我國發展上的重要性[5-6]。在當今日益追求健康飲食的社會生活中，雜糧因其膳食纖維豐富等原因倍受追崇，黍稷作為五谷雜糧之一，其營養成分豐富，不僅含有蛋白質、脂肪、維生素和礦物質元素等人體基本營養素，且這類營養素含量普遍高于小麥、大米等我們較常食用的谷類[7-8]。在近些年的研究中，人們認識到黍稷具有的營養價值很高，也能達到一定的保健功效，是較為經濟、實惠、安全、有療效的食療食品，其開發的前景十分廣闊[9]。

SSR（Simple sequence repeat，簡單序列重復）分子標記法具有分布均勻、數量豐富、穩定性好、技術相對完善等優點，主要在物種的基因型鑒定與品種保護、種子的純度評價和種質保存、分子標記輔助選擇育種、資源鑒定等領域中應用。SSR標記也是目前應用較為廣泛的遺傳標記技術[10]，在花生[11]、花椰菜[12]、棉花[13]、高粱[14]等多種作物種質資源的遺傳多樣性分析中應用。SSR標記也能從DNA水平直接鑒定出品種之間的遺傳差異[15]。國際植物新品種保護聯盟（UPOV）利用SSR和SNP（Single nucleotide polymorphism，單核酸多態性）作為分子標記構建作物品種DNA指紋數據庫[16]。SSR標記結合毛細管電泳技術，具有的高通量、高精度、高效率等優點，可用于大量材料的檢測評定，在大豆[17]、玉米[18]、小麥[19]、水稻[20]、柑橘[21]、菜豆[22]等作物品種的DNA指紋數據庫構建中應用。DNA條形碼就是基于在SSR分子標記技術，將種間基因水平差異用數字轉化成條形碼的形式，使品種有一個由特定數字組成的代碼，對種質資源的知識產權的保護和管理具有重要作用[23-25]。DNA條形碼自2003年首次提出后，已在糧食作物（小麥和玉米等）、水果（蘋果和桃等）和油料作物（芝麻、花生等）中廣泛應用，使資源實現了數字化和網絡化管理。

我國種質資源庫已有黍稷資源9 885份，地方品種占99.4%，育成品種占0.6%，種質資源豐富，對黍稷資源的開發利用具有重大意義[26]。由于黍稷新資源的不斷采集和引進，種質資源的交流越來越頻繁，導致農產品品種、良種、地方品種和野生品種之間出現大量的同源異義現象，農家品種流通不足，無法發揮出優良品種的最大價值，造成種質資源嚴重浪費，極大地影響了資源的采集和整理效率[27]。因此，創建準確可靠且操作便捷的資源鑒定系統勢在必行，需為黍稷品種制定一份專屬的DNA分子身份證，以便更好的開發和利用黍稷種質資源[28]。在目前研究中，已有陸徐忠等[29]從48對SSR熒光引物中篩選出12對作為核心引物，構建了安徽省水稻品種127個分子指紋圖譜。侯麗媛等[30]從16對熒光SSR引物中篩選出7對引物，構建了包括蘋果新品種赤霞在內的20個品種的分子識別卡。黍稷作為一種小雜糧，其分子身份證的構建報道極少。將條形碼引入黍稷資源管理，編輯黍稷資源信息，使其具有特定的數字編碼，可以解決目前存在的問題，有助于保護種質資源的知識產權[31-33]。

本研究采用SSR分子標記法，選取中國北方具有代表性的20份黍稷材料，利用14對高基元引物，擬構建20份黍稷資源的分子身份證，為黍稷資源的高效分類和應用提供一定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗選用中國北方大部分地區20份有顯著差異的黍稷材料，山西省（2份）、陜西省（4份）、黑龍江（1份）、內蒙古（4份）、河南（1份）、寧夏（3份）、甘肅省（4份）、和青海省（1份）8個省共20份黍稷資源進行種植，于三葉期取葉片0.3 g，液氮速凍保存至-80℃冰箱。20份材料如表1所示。

1.2 試劑和儀器

試劑：氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇瓊脂糖、0.5×TBE電泳緩沖液、6×DNA loading buffer、dd H2O、2×TaqPCR MasterMix含染料、30%的丙烯酰胺、TBE電泳緩沖液、過硫酸銨、TEMED、50 bp Marker、AgNO3、Na OH、甲醛CTAB裂解液。

儀器：離心機、冰箱、BIO-GENER、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機、基因擴增儀、渦旋儀、Nanodrop ND-1000核酸濃度檢測儀、微波爐、瓊脂糖凝膠電泳儀、Bio-Rad凝膠成像儀、移液槍。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取和檢測 剪取三葉期葉片，采用改良CTAB法[34]提取基因組DNA。利用NanodropND-1000核酸濃度檢測儀檢測DNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳以檢測DNA的完整性[35]。

表1 20份黍稷試驗材料Tab.1 The detail of 20 broomcorn millet accessions in this experiment

1.3.2 引物篩選、PCR擴增及產物檢測 用14對高基元引物（表2）擴增地理來源差異較大的20份黍稷資源，篩選條帶清晰、擴增穩定且多態性較高的引物用于構建分子身份證。20μL PCR體系含10μL 2×MasterMix（中 科 瑞 泰2×Taq PCR MasterMix含染料）、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、7.4μL dd H2O和1μL DNA模板。反應程序為94℃4 min；94℃40 s，退火溫度40 s，72℃1 min，36個循環；72℃8 min[28]。

表2 SSR引物的序列及退火溫度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

1.4 數據處理

根據PCR擴增條帶的基因組數據，有條帶讀“1”，無條帶讀“0”。用PowerMarker 3.25[36]軟件計算每個引物的多態性信息含量指數（PIC），用PopGen 1.32[37]計算不同樣品間的Nei's遺傳距離。利用東北農業大學開發的ID Analysis 4.0軟件建立分子身份證。輸入相應的字符串并使用聯機條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）產生DNA條形碼；黍稷種質基本信息及身份證通過在線二維碼輸入技術（https://cli.im/）產生相應的DNA二維碼。

2 結果與分析

2.1 試驗SSR的引物篩選結果

從北方黍稷栽培區選取黍稷材料共20份，對五、六堿基引物共14對SSR引物篩選，結果表明，材料相似系數為0.8，缺失引物占比為50%。其中,有4對引物與其他引物相似系數過高，被剔除。10對引物能夠擴增出條帶清晰、穩定性好、多態性高的引物，可用于分子身份證的構建的核心引物。

2.2 引物多態性及遺傳參數分析

用10對引物對20份黍稷種質進行了擴增。由表3可知，在20份材料的10個基因座中檢測到30個等位基因，每個基因座中檢測到3個等位基因（平均3.000 0）；有效等位變異（Na）為1.662 3（RYW7）~2.792 3（RYW12），平均為2.455 3；Shannon多樣性指數（I）為0.702 9（RYW7）~1.088 0（RYW2），平均值為0.958 8；雜合度（Ho）為0.500 0（RYW7）~0.823 5（RYW12），平均值為0.686 6；期望雜合度（He）為0.411 3（RYW7）~0.686 2（RYW2），平均 值為0.602 4；Nei's的基因多樣性指數（Nei）為0.398 4（RYW7）~0.659 8（RYW2），平均值為0.582 8；多態信息含量（PIC）在0.488 6（RYW3）~0.776 6（RYW8），平均值為0.629 8。

表3 10個SSR的遺傳多樣性參數Tab.3 Genetic diversity parameters of 10 SSR markers

2.3 北方栽培區黍稷的DNA分子身份證構建

本試驗采用多個引物的等位基因組合來劃分品種，獲得分子身份證的引物為RYW10、RYW6、RYW7、RYW5、RYW1、RYW2、RYW8和RYW3共8對引物可將全部黍稷材料區分開來。將10對引物用排列組合方式構建DNA分子身份證的即字符串DNA分子身份證。各品種詳細編碼如表4所示，最終獲得各品種的二維碼和條形碼表示其DNA分子身份證（圖1）。以表4中編號1材料為例，其字符串DNA分子身份證為10111110，表示在上述引物順序下材料1中在引物RYW10顯示有條帶、RYW6顯示無條帶、RYW7顯示有條帶，依次類推，到引物RYW3無條帶，即黍稷材料1的字符串DNA分子身份。

表4 20份黍稷資源的分子身份證編碼Tab.4 Code of molecular ID of 20 broomcorn millet resources

3 討論

3.1 SSR遺傳多樣性衡量參數

黍稷是一種遺傳變異多樣的古老作物，已有大量相關研究。前人研究表明，黍稷基因多樣性指數分別為0.736 0、0.768 6、0.628 4、0.841 5、0.847 8和0.859 9，多態性信息含量分別為0.554 4、0.457 3、0.427 9、0.587 4、0.471 4和0.566 7[25-26，35，38-40]。本研究對8個省的黍稷材料進行了分析，數據在其范圍中。

3.2 DNA指紋圖譜和分子身份證編碼

DNA指紋是一種通過比較電泳指紋的差異來區分生物個體差異的方法。然而，由于DNA指紋圖譜條帶多，人工比對和解釋費時費力，統計分析繁瑣，限制了大規模物種鑒定的應用。DNA分子身份證是以前者為基礎，采用不同的編碼方法對電泳圖進行數字化，得到字符串結果，并輔以條形碼、二維碼等科學的表示方法，使品種比對更加高效、方便、準確，克服了手工比對指紋繁瑣、效率低下的缺點，廣泛應用于品種鑒定。以往的研究利用SSR標記構建品種的分子識別卡，常用的編碼方法有以下3種：0/1編碼型，根據電泳條帶有無，賦值1或0，形成0和1串[41]。等位基因分配編碼型，編碼擴增的等位基因[42]。基因型被指定為編碼類型，引物擴增的條帶被編碼[24]。本研究采用第1種凝膠電泳法進行編碼，具有編寫簡單、統計方便、字長適中、檢索方便等優點。

3.3 PAGE銀染法構建DNA分子身份證的可行性研究

到目前為止，檢測SSR標記的方法主要有2種，即PAGE銀染法和熒光毛細管電泳法。楊文娟等[43]用這2種方法檢測了131份應用核心種質，PAGE銀染法所得數據與毛細管電泳結果基本一致。另外，許多研究者對此進行了研究，試驗結果對PAGE方法是肯定的。另外，常規變性PAGE銀染法不需要昂貴的實驗儀器，試劑成本低，適合于少量物質的分析。普通引物可以保存3~5 a，而熒光標記引物只能保存1~2 a，因此后者的合成成本遠高于前者。因此，在引物質量可靠、試驗材料少、經濟條件有限的前提下，采用PAGE銀染法構建DNA分子身份證是可行的。

3.4 用高堿度引物構建分子身份證

過去，低基元的SSR被用來構建資源的分子身份證。張嘉等[44]從111對引物中篩選出29對SSR核心引物，最終用4對雙堿基引物構建了66個中國芍藥分子識別卡。郭艷春等[45]結合高、低堿基引物構建分子身份證，用12對熒光SSR引物組合（1、4、4、1、2對單堿基、二堿基、三堿基、四堿基和五堿基）構建了61張黃麻核心種質分子身份證。本研究用8對高堿基（4堿基重復基序）引物檢測了2個遺傳多樣性參數指標，即基因多樣性指數1.043 7和多態性信息含量0.690 5，均高于低堿基[25，46]。

4 結論

本試驗在14對SSR引物中篩選出10對適宜堿基引物對北方地區的20份黍稷種質進行鑒定，將北方地區的黍稷種質品種及其近緣野生種和育成品種的信息資料進行分類匯總，構建了20份糜子種質的條形碼DNA分子身份證和二維碼DNA分子身份證。