菌核病不同發病率的菜田土壤中真菌多樣性分析

陶 禹,李東波,李興杰,陳士亮,嚴振寧,奧巖松*

(1上海交通大學農業與生物學院,上海200240;2宜春學院生命科學與資源環境學院,宜春336600;3上海春昌蔬果專業合作社,上海201706)

菌核病是一種分布廣、寄主多的常見土傳真菌病害,易對多種作物如油菜、向日葵等造成危害,導致其嚴重減產、品質下降等[1-2],其病原菌由核盤菌屬(Sclerotinia)的多種真菌構成[3]。菌核病傳播途徑多、速度快,菌核形態下的核盤菌對多種逆境有較強的抵抗能力,生產上防治該病難度極大[4]。目前,菌核病的防治主要依賴于化學農藥,而長期用藥會使病原菌產生抗藥性,且對環境造成污染[5]。農藝防治等措施作用時間長,防治效率低,不適用于現代農業生產。“以菌治菌”的生物防治方法因其綠色、環保且不會造成有害殘留等優點,受到廣泛提倡[6]。

應用拮抗微生物防治菌核病已有大量研究,其中芽胞桿菌[7]、木霉[8]和盾殼菌[9]等對核盤菌具有顯著抑制作用。發病土壤是拮抗微生物的重要來源之一[10-11]。農田生態系統復雜,生產上利用拮抗微生物防治菌核病效果不穩定、效率低[12-14]。李曉輝等[15]研究發現,核盤菌菌核圍與非菌核圍土壤的微生物多樣性具有顯著差異,表明土壤微生物群落的結構組成和多樣性變化可能對菌核病的發生、發展具有重要的作用。

二代高通量測序技術(Illumina MiSeq測序)具有準確性高、靈敏度強等優勢,已廣泛用于土壤微生物多樣性的研究。本研究以菌核病不同發病率的菜田土壤為試驗材料,利用高通量測序技術分析土壤真菌群落結構及多樣性變化,旨在闡明核盤菌與土壤真菌多樣性之間的關系,以期提高菌核病生物防治效果。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

于2019年11月自上海市青浦區春昌蔬果專業合作社發病菜田取土樣。參照劉彬等[16]的方法鑒定土壤中的病原菌,確定其為小菌核菌(Sclerotinia minor)。根據病害程度與病原菌序列豐度將發病菜田土壤劃分為無病害組(CK)、輕度病害組(LIT)和重度病害組(SEV)(表1)。

表1 土壤樣本病害程度劃分Table 1 Classification standard of disease degree of soil samples

用“S”形采樣法,在病害程度不同的土壤樣地選定6個采樣點,用五分法取樣。以采樣點為中心,取半徑為10 cm,深度為5—15 cm的土壤,除去植株殘體,過2 mm篩后裝入無菌PE密封袋。共采集18份土壤樣品,將每份土壤樣品分為兩部分,一部分保存于-80℃冰箱中用于高通量測序分析,另一部分室溫風干后用于土壤理化性質測定。

1.2 土壤理化性質測定

土壤pH用pH計(型號為FE28,METTLER TOLEDO上海有限公司)測定;有機質含量采用重鉻酸鉀-容量法測定;土壤全氮和全磷含量用AA3連續流動分析儀測定;土壤全鉀含量采用氫氧化鈉熔融法測定;速效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定;速效鉀含量用乙酸銨浸提-火焰原子吸收法測定;速效氮含量用堿解擴散法測定。

1.3 土壤真菌的高通量測序

1.3.1 土壤總DNA的提取

準確稱量200 mg土樣,放入2 mL無菌離心管中,加入1 mL 75%乙醇,振蕩混勻,10 000×g,4℃離心3 min,棄上清液。加入1×PBS溶液,振蕩混勻,10 000×g,4℃離心3 min,棄上清液,參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)使用說明書提取土壤樣品基因組DNA。

1.3.2 樣品土壤Illumina MiSeq測序

真菌基因組擴增的特異引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR反應程序:94℃5 min;94℃40 s,54℃30 s,72℃40 s,37個循環;72℃10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。利用AxyoreoDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物,Tris-HCl洗脫,然后利用QuantiFlourTm-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)獲得純化PCR產物,由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。

1.4 數據處理

利用Excel 2010軟件統計數據。利用R語言進行單因素方差分析(ANOVA),用最小顯著性差異法進行分析。利用Mothur(version v.1.30.1)計算Alpha多樣性指數。利用Qiime軟件計算Beta多樣性指數,利用R語言Vegan包進行NMDS分析(Bray curtis距離)并用R語言進行作圖。

2 結果與分析

2.1 菌核病不同發病率的菜田土壤的理化性質

由表2可知,土壤樣品均為弱酸性,SEV組pH顯著低于LIT組與CK組(P＜0.05)。LIT組與SEV組的土壤有機質、全磷、全鉀、速效氮含量等均顯著高于CK組(P＜0.05),SEV組的速效磷含量顯著高于CK組,而各組間速效鉀含量無顯著差異。土壤有機質、全磷、全鉀含量的顯著增多說明發生菌核病的菜田中施肥較多,而速效氮、速效磷含量的增多則可能與土壤中的腐生真菌相對豐度增多有關[17]。

2.2 菌核病不同發病率的菜田土壤中真菌多樣性測序數據統計

測序數據優化后,CK組有64 699條高質量序列片段,15 539 138個堿基,序列平均長度為240 bp。LIT組有64 340條片段,15 340 609個堿基,序列長度為238 bp。SEV組有57 738條片段,13 899 158個堿基,序列長度為240 bp。由圖1可知,隨著序列增多,Shannon指數趨于穩定,表明測序數據量足夠大,可以反映樣本中絕大多數的真菌多樣性信息。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

2.3 菌核病不同發病率的菜田土壤中真菌Alpha多樣性分析

由表3可知,各樣品的覆蓋度指數(Coverage)均達到0.999以上。隨著菌核病發病率的升高,相較于LIT組,SEV組物種豐富度Sobs指數顯著降低(P＜0.05)。物種多樣性Simpson和Shannon指數無顯著差異(P＞0.05)。

表3 不同土壤樣品中真菌群落的Alpha多樣性指數Table 3 Alpha diversity index of fungal community in different soil samples(Genus level)

2.4 菌核病不同發病率的菜田土壤中真菌Beta多樣性分析

在屬水平上進行NMDS(Non-metric multidimensional scaling analysis)分析,其脅強指數(stress)為0.111。由圖2可知,土壤樣品劃分為3個類群,其中CK組為類群I,LIT組為類群II,SEV組為類群III,三個類群間具有極顯著差異(P＜0.01),表明不同發病率的病害土壤中的真菌多樣性具有顯著差異。

圖2 不同土壤樣品中真菌群落的NMDS分析Fig.2 NMDSanalysis of fungal communities in different soil samples

2.5 菌核病不同發病率的菜田土壤中真菌的群落結構組成

土壤樣品中真菌共聚類于10個門,30個綱,63個目,122個科,208個屬,324個種,825個分類操作單元(OTU)。

在門水平上(圖3、圖4),3組(CK、LIT和SEV)均含有子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、unclassified-k-Fungi、壺菌門(Chytridiomycota)、隱真菌門(Rozellomycota)和捕蟲霉門(Zoopagomycota),其中子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度之和均在88%以上;只在LIT組與SEV組中具有的真菌門為蛙糞霉門(Basidiobolomycota)和芽枝霉門(Blastocladiomycota);只在 SEV組中具有的真菌門為Calcarisporiellomycota。

在屬水平上(圖3、圖4),3組(CK、LIT和SEV)中有120屬為共有真菌,特有真菌屬數目分別為19、23、21。3組中共檢出高豐度真菌(平均相對豐度1%—5%)11個屬,其中優勢真菌(平均相對豐度≥5%)有7個屬。相對豐度從高到低依次為小被孢霉屬(Mortierella)、絲葚霉屬(Papulaspora)、unclassified-f-Pyronemataceae、unclassified-f-Cheatomiaceae、毛殼屬(Cheatomium)、瓶毛殼屬(Lophotrichus)、unclassified-f-Agaricomycetes。各組樣品中,這7個屬真菌的相對豐度之和均大于75%。

圖3 不同土壤樣品中真菌的Venn圖分析Fig.3 Venn analysis of fungi in different soil samples

圖4 不同土壤樣品中真菌的物種群落組成Fig.4 Species composition of fungi in different soil samples

2.6 菌核病不同發病率的菜田土壤中高豐度真菌的變化

由圖5可知,3組的優勢真菌中(平均相對豐度≥5%),CK組小被孢霉屬(Mortierella)相對豐度為21.49%,LIT組為21.70%,SEV組為15.87%,其中LIT組與SEV組間差異達到顯著水平(P＜0.05);CK組絲葚霉屬(Papulaspora)相對豐度為24.56%,LIT組為8.66%,SEV組為16.52%,三組間的差異均達到顯著水平(P＜0.05);CK組unclassified-f-Pyronemataceae相對豐度為4.10%,LIT組為17.63%,SEV組為20.34%,LIT組和CK組間、SEV組和CK組間的差異均達到顯著水平(P＜0.05);CK組unclassified-f-Cheatomiaceae相對豐度為6.50%,LIT組為15.00%,SEV組為7.65%,LIT組和CK組間、LIT組和SEV組間的差異均達到顯著水平(P＜0.05)。CK組毛殼屬(Cheatomium)相對豐度為6.90%,LIT組為2.69%,SEV組為11.15%,LIT組與SEV組間的差異達到極顯著水平(P＜0.01)。

圖5 不同土壤樣品中高豐度真菌的相對豐度Fig.5 Relative abundance of high abundance fungi in different soil samples

3組的高豐度真菌中(平均相對豐度1%—5%),CK組、LIT組、SEV組鐮刀菌屬(Fusarium)的相對豐度分別為3.30%,3.28%和2.47%。新赤殼屬(Neocosmospora)的相對豐度分別為2.38%、3.40%和1.45%,3組之間的相對豐度差異均達到顯著水平(P＜0.05)。unclassified-o-Sordariales的相對豐度分別為2.98%、1.42%和1.16%,CK組與LIT組,CK組與SEV組間差異均達到極顯著水平(P＜0.01)。unclassified-c-Sordariomycetes的相對豐度分別為1.01%、0.78%和0.63%。CK組核盤菌屬(Sclerotinia)的相對豐度相對低于1%,3組之間的相對豐度差異均達到極顯著水平(P＜0.01)。LIT組絲孢酵母屬(Trichosporon)相對豐度為1.47%,在其他兩組中的相對豐度均低于1%,相對豐度差異達極顯著水平(P＜0.01)。

在屬水平下,隨著核盤菌的相對豐度增加,各屬真菌相對豐度變化趨勢可分為四種類型,分別為(1)相對豐度下降:瓶毛殼屬(Lophotrichus)、unclassified-f-Agaricomycetes、unclassified-o-Sordariales、unclassified-c-Sordariomycetes和鐮刀菌屬(Fusarium)。(2)相對豐度先降低后增加:絲葚霉屬(Papulaspora)、毛殼屬(Cheatomium)、尾柄孢殼屬(Cercophora)、翅孢殼屬(Emericellopsis)、unclassified-p-Ascomycota和絲孢酵母屬(Trichosporon)。(3)相對豐度先增加后降低:被孢霉屬(Mortierella)、unclassified-f-Cheatomiaceae、新赤殼屬(Neocosmospora)、unclassified-p-Rozellomycota和絲孢酵母屬(Trichosporon);(4)相對豐度上升:unclassified-f-Pyronemataceae。

2.7 菌核病不同發病率的菜田土壤中真菌的功能分析

由圖6可知,根據FUNGuild功能預測可將土壤中的真菌劃分為10個功能菌群,其中與植物病理有關的功能類群有植物病理寄生類菌群(Plant Pathogen)和植物病理-腐生-共生類菌群(Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parastie-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph)。CK組植物病理寄生類菌群相對豐度為1.43%,LIT組為0.79%,SEV組為3.54%;CK組植物病理-腐生-共生菌群種相對豐度為3.28%,LIT組為3.30%,SEV組為2.47%。LIT組中植物病理寄生類菌群的相對豐度為4.09%,SEV組中植物病理寄生類菌群為6.01%。

圖6 不同土壤樣品中高豐度真菌的功能分析Fig.6 Fungal functional of high abundance fungi in different soil samples

3 討論與結論

本研究中,與對照組相比,SEV組土壤真菌群落豐富度Sobs指數顯著下降(P＜0.05),多樣性Simpson、Shannon指數無顯著差異,與前人的研究結果不同[15],可能與栽培植物種類不同有關;NMDS分析表明各土壤樣本中真菌群落Beta多樣性之間有極顯著差異(P＜0.01)。門水平上,相對于CK組,LIT組特有的2個門為蛙糞霉門和芽枝霉門,SEV組特有的門為Calcarisporiellomycota。屬水平上,CK組155屬真菌中有19屬特有真菌,LIT組162屬真菌中有23屬特有真菌,SEV組156屬真菌中有21屬特有真菌,這表明菌核病不同發病率的土壤中真菌種類差異較大。綜上,小核盤菌會對土壤中真菌群落組成和多樣性變化產生顯著影響。

由物種群落組成與功能分析可知,土壤中的高豐度真菌(11屬)與優勢真菌(7屬)可分為三類:對核盤菌具有拮抗作用的腐生型真菌、有益腐生型真菌和病理營養型真菌。對核盤菌具有拮抗作用的腐生型真菌(4屬):unclassified-f-Cheatomiaceae、毛殼屬、小被孢霉屬和絲孢酵母屬。其中unclassified-f-Cheatomiaceae與毛殼屬同屬于毛殼菌科,但這兩屬相對豐度變化趨勢相反。研究表明,毛殼菌對部分小麥赤霉病菌有高抑制作用,而對棉花枯萎病病原菌與南瓜枯萎病病原菌則沒有明顯的抑制作用[19]。賈艷梅等[20]認為,部分毛殼菌科對植物具有致病作用。球毛殼菌對小麥葉枯病病原菌、稻瘟病病原菌有抑制作用[21-22]。李治瑩等[23]發現,毛殼菌科對于多種真菌都具拮抗作用。小被孢霉屬相對豐度較低,與苗翠平等[24]研究結果相同。黃芳芳[25]認為,被孢霉菌可以控制三七根腐病病原菌,核盤菌與小被孢霉屬之間可能存在相互拮抗關系。范青等[26]發現,絲孢酵母屬真菌對病原菌具有營養競爭作用。本試驗中,絲孢酵母屬在LIT組中相對豐度較高,同時絲孢酵母屬也可作為核盤菌侵染時的指示真菌。

有益腐生型真菌(6屬):unclassified-f-Pyronemataceae、unclassified-f-Agaricomycetes、unclassified-o-Sordariales、unclassified-c-Sordariomycetes、尾柄孢殼屬和翅孢殼屬。尾柄孢殼屬常見于草食性動物糞便上,翅孢殼屬從功能分析與科級分類中為腐生菌[27]。unclassified-f-Pyronemataceae、unclassified-f-Agaricomycetes、unclassified-o-Sordariales、unclassified-c-Sordariomycetes是常見的有益土壤腐生營養菌。

病理營養型真菌(3屬):瓶毛殼屬、新赤殼屬和鐮刀菌屬。瓶毛殼屬的多數真菌為土壤病原菌[28];新赤殼屬真菌是造成松樹潰瘍病的病原菌[29];鐮刀菌屬是引起多種植物病害的致病性真菌[30]。與CK相比,上述三種真菌相對豐度均下降,說明不同致病菌種之間存在競爭關系。

綜上,小核盤菌會對土壤中門水平下與屬水平下的真菌群落組成以及Beta多樣性產生顯著影響,其中SEV組中特有蛙糞霉門、芽枝霉門和Calcarisporiellomycota,LIT組中特有蛙糞霉門和芽枝霉門。土壤中的小被孢霉屬和絲孢酵母屬可能對病原菌有拮抗作用,具備分離出高抑制性的菌株的潛力,同時絲孢酵母屬也可作為核盤菌侵染時的指示真菌。