光照對紫葉稠李花色素苷合成調控通路的影響

馬 赫,蔡建超,張克中,崔金騰

(北京農學院園林學院/城鄉生態環境北京實驗室/北京市鄉村景觀規劃設計工程技術研究中心,北京 102206)

紫葉稠李(Padus virginiana)是薔薇科稠李屬落葉喬木,株高10—14 m,是一種珍貴的彩葉樹種,在我國北方,氣溫達到一定程度,紫葉稠李的初生葉由綠色逐漸轉為紫紅色,葉色靚麗極具觀賞價值[1-2]。

植物葉色變化主要由色素含量的相對變化引起,花青素是植物體內的天然色素[3],可以遮擋部分強光,幫助植物抵御環境脅迫,降低光合作用對葉片的傷害[4],朱書香等[5]通過研究4種李屬植物,發現花色素苷能夠形成“光屏障”,吸收植物體內的過剩光,緩解強光對植物光合作用的影響。

花青素的合成以苯丙氨酸為底物,經酶促反應、糖基化、酰基化等過程最終達到穩定狀態,參與合成的有PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT等結構基因及MYB、bHLH、WD40等轉錄因子[6]。MYB轉錄因子對植物積累花青素具有重要意義,可通過調控花色素苷水平調控蘋果果皮的紅色和綠色條紋[7]。在楊樹中,MYB6正向調控花青素和單寧生物合成。MYB、bHLH和WD40互作可形成三元復合物,參與調節晚期類黃酮生物合成基因的表達[8]。

本研究基于花青素光保護理論對紫葉稠李進行遮光處理,結合轉錄組測序及生物信息學分析,對花青素合成通路上的關鍵結構基因和MYB家族轉錄因子MYB6和MYB10進行驗證,以期為紫葉稠李花色素苷調控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

北京農學院實踐基地中陸地生長的2年生紫葉稠李(Padus virginiana)扦插苗。

1.2 遮光處理

選取長勢良好的紫葉稠李60棵,30棵進行20%光照處理(采用80%遮陽網),另外30棵在自然條件全光照下生長。試驗期間,進行常規管理,保持植株長勢良好。遮光處理前1 d采集1次葉片,采集部位為頂端倒3葉,命名為Day0,處理30 d后,再分別采集1次葉片,20%光照處理組命名為ST_Day30,自然條件全光照處理組命名為Day30。試驗時間為2019年4月至5月。

1.3 葉色參數測定

采用柯尼卡美能達(中國)投資公司的色彩色差計(CR-400/410)測定葉色參數,L*表示照度,相當于亮度,L*的值域由0到100,表示由黑色向白色轉變。a*和b*的值域都是-127至+128,a*表示由綠色向紅色轉變;b*表示由藍色向黃色轉變,所有顏色以這三個值交互變化表示。

1.4 花色素苷含量測定

采用鹽酸提取比色法測定花色素苷含量[5],稱取植物樣品0.50 g,置于離心管中,加0.1 mol/L鹽酸溶液20 mL,使樣品完全浸于溶液中,置于32℃恒溫箱中浸提8 h,使用光徑1 cm的比色皿,以0.1 mol/L鹽酸為空白對照,測量波長530 nm下的吸光值。花色素苷含量(mg/L)=A(530)/0.1×樣品質量(g)

1.5 RNA的提取和轉錄組測序

使用北京艾德萊生物科技有限公司EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒,提取紫葉稠李葉片總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用Nanodrop2000檢測RNA的濃度和純度。采用Illumina Hiseq 2500進行轉錄組測序,由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.6 基因功能注釋、轉錄因子預測和差異基因分析

將拼接得到Unigene序列與Nr、Swiss-Prot、Pfam、KOG、GO和KEGG六大數據庫比對獲得功能注釋,與PlantTFDB數據庫比對得到轉錄因子信息,利用DEGseq進行組間差異表達分析,通過與GO和KEGG數據庫比對,獲得差異基因的功能注釋及通路注釋。

1.7 關鍵基因的qRT-PCR

使用北京全式金生物技術有限公司試劑盒TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SupperMix將RNA反轉錄為cDNA,PCR程序設定為:55℃30 min,85℃5 s。使用北京全式金生物技術有限公司試劑盒TransScripTtop Green qPCR SupperMix配置熒光定量體系,qPCR程序設定為:94℃30 s,94℃5 s,60℃10 s,70℃10 s,45 cycles。所用引物見表1。根據富集結果篩選出花色素苷代謝通路PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT八個關鍵功能基因及轉錄因子MYB6和MYB10并進行實時熒光定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primers and sequences

2 結果與分析

2.1 遮光對紫葉稠李葉色參數的影響

光照是影響彩葉植物葉色變化的重要環境因子之一,在長期的進化過程中,植物通過改變形態結構、生理生化等方式應對復雜的光環境[1]。由圖1和圖2可知,自然全光照的葉片由綠色變為紫紅色,80%遮光處理30 d后的紫葉稠李葉片并未完全變色,與全光照30 d的葉片相比,a*值減小,b*值增加,葉片亮度L*值增強,葉面與葉背顏色不同,葉面偏綠色,葉背偏紫紅色。

圖1 光照強度對紫葉稠李葉片顏色變化的影響Fig.1 Effects of light intensity on leaf color change of Padus virginiana

圖2 遮光對紫葉稠李葉色參數的影響Fig.2 Effects of shading on leaf color parameters of Padus virginiana

2.2 遮光對紫葉稠李葉片中花色素苷含量的影響

光照可通過促進可溶性糖的積累來激活花色素苷合成的某些酶類,從而促進花色素苷的合成。全光照30 d后葉片花色素苷含量顯著提高,而遮光處理30 d的葉片,花色素苷雖然也有積累,但伴隨著光照強度的減弱,積累量明顯小于全光照組(圖3)。

圖3 遮光對紫葉稠李葉片花色素苷含量的影響Fig.3 Effects of shading on the anthocyanin content of Padus virginiana

2.3 紫葉稠李轉錄組測序質量統計

對Day0、Day30、ST_Day30三個試驗組進行轉錄組測序,設置兩次重復,總共獲得145.87GB的Clean Data,具體結果見表2。Day0、Day30、ST_Day30分別獲得Clean reads 102 560 220、118 348 698、112 063 772,單次重復獲得的Clean reads大于46 931 024,N50值1 266 bp,Q20值超過98%,Q30值超過94%,GC含量處于46%—47.1%,無AT和GC分離,測序數據質量較高。圖4顯示,Unigene的長度分布于1—400區間的最多,達到了40 000以上,隨著分布區間的變長,數量逐漸減少。

圖4 紫葉稠李Unigene長度分布Fig.4 Length distribution of Unigenes of Padus virginiana

表2 質控數據統計Table 2 Quality control data statistics

2.4 紫葉稠李轉錄組Unigene的功能注釋

本試驗中紫葉稠李為無參轉錄組測序,將該次轉錄組測序獲得的所有轉錄本與六大數據庫(NR,Swiss-Prot,Pfam,COG,GO和KEGG數據庫)進行比對,E-value值設為1e-3,Unigene所占比例分別為52.3 %、42.83%、34.8%、10.17%、20.62%、27.41%、58.62%,Unigene在NR和KEGG數據庫中比對占比最高(表3)。

表3 Unigene與數據庫比對結果Table 3 Comparison of Unigene and six databases

NCBI_NR為綜合數據庫,其中包含Swiss-Prot、PIR、PRF、PDB等蛋白質數據庫中非冗余的數據以及從GenBank和RefSeq的CDS數據庫中翻譯所得的蛋白質數據。通過與NR數據庫的比對,可以查看紫葉稠李轉錄本序列與相近物種的相似情況,以及同源序列的功能信息。NR注釋顯示紫葉稠李與歐李(Prunus avium,31%)、桃(Prunus persica,24.17%)、梅(Prunus mume,14.52%)3個物種同源關系最近(圖5)。

圖5 紫葉稠李NR庫比對物種分布占比Fig.5 Distribution of species distribution in Padus virginiana NR library

2.5 遮光對紫葉稠李基因表達的影響

設置Day30_vs_ST_Day30、Day0_vs_Day30、Day0_vs_ST_Day30三個組件對比分析。對不同樣品間的raw counts進行基于TMM方法的標準化,默認利用DEGseq軟件進行組間差異表達分析,默認閾值:padjust＜0.05&|log2FC|＞=1。以基因在兩個樣本間表達差異的倍數變化值為橫坐標,P值為縱坐標,繪制差異基因表達火山圖(圖6),從圖中可看出,Day30_vs_ST_Day30差異表達基因共2 432條,其中上調1 396條,下調1 036條;Day0_vs_Day30差異表達基因共2 811條,其中上調806條,下調2 005條;Day0_vs_ST_Day30差異表達基因共3 368條,上調1 376條,下調1 992條。

圖6 遮光處理下紫葉稠李差異基因表達分析Fig.6 The analysis of differential gene expression of Padus virginiana in shading

通過與GO數據庫比對,對紫葉稠李的差異基因按照其細胞組分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)和參與的生物過程(Biological Process)進行分類注釋,篩選顯著富集在前20位的Go Term繪制折線圖(圖7),設置篩選參數P值(FDR)＜0.05,由圖7可知,Day30 vs ST_Day30有1 125條基因富集到177個GO term中,其中,主要富集在細胞大分子代謝過程(Cellular macromolecule metabolic process)、細胞過程(Cellular process)、細胞內部分(Intracellular part)、氧化還原過程(Oxidation-reduction process)、氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、氮化合物代謝過程(Nitrogen compound metabolic process);Day0 vs Day30有1 396條基因富集到211個GO term中,其中,主要富集在碳水化合物代謝過程(Carbohydrate metabolic process)、細胞碳水化合物代謝過程(Cellular carbohydrate metabolic process)、多糖代謝過程(Polysaccharide metabolic process)、細胞壁組織(Cell wall organization)、細胞多糖代謝過程(Cellular polysaccharide metabolic process)、細胞外區域(Extracellular region)、蛋白質復合物(Protein complex)、外部封裝結構(External encapsulating structure);Day0 vs ST_Day30有1 069條基因富集到215個GO term中,其中,主要富集在催化活性(Catalytic activity)、細胞內部分(Intracellular part)、氧化還原過程(Oxidation-reduction process)。

圖7 遮光處理下紫葉稠李差異基因GO富集分析Fig.7 The analysis of differentially expressed genes in GO enrichment of Padus virginiana in shading

通過與KEGG數據庫比對,獲得紫葉稠李的基因或轉錄本對應的KO編號,根據KO編號獲得Unigene可能參與的具體生物學通路情況。紫葉稠李KEGG注釋到遺傳信息處理(Genetic Information Processing),代謝(Metabolism),環境信息處理(Environmental Information Processing),細胞過程(Cellular Processes),生物體系統(Organismal Systems)等通路,篩選顯著富集在前10位的差異基因繪制KEGG代謝通路氣泡圖(圖8),設置篩選參數P值(FDR)＜0.05。在Day30 vs ST_Day30顯著富集在前10位的代謝通路中,苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氰氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)、植物激素信號轉導(Plant hormone signal transduction)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為50、38、27、38和15個差異基因;Day0 vs Day30顯著富集在前10位的代謝通路中,苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、植物激素信號轉導(Plant hormone signal transduction)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)和氰氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為40、32、32、24和24個差異基因;Day0 vs ST_Day30顯著性富集在前10位的代謝通路中,苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)和類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)5條代謝途徑富集的差異基因較多,分別為36、27、46、36和18個差異基因。

圖8 遮光處理下紫葉稠李差異基因KEGG富集分析Fig.8 The analysis of differential expression gene KEGG enrichment of Padus virginiana in shading

Day0 vs ST_Day30有279條差異基因顯著富集到14條代謝通路上,為苯丙烷類生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、類黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)代謝途徑。

2.6 紫葉稠李轉錄因子統計

轉錄因子是一類能與基因5’端上游特定序列專一性結合,調控目的基因以特定強度在特定時空表達的蛋白質分子。通過與PlantTFDB 4.0數據庫比對,得到紫葉稠李轉錄因子1 261條,其中MYB超級家族最多,共有213條,占總數的17%,數量是其他轉錄因子的兩倍以上,AP2/ERF家族96條,bHLH家族87條,NAC家族68條,bZIP家族59條(圖9)。

圖9 遮光處理下紫葉稠李轉錄因子統計Fig.9 Transcription factor statistics of Padus virginiana in shading

2.7 紫葉稠李花青素合成途徑關鍵基因的qRT-PCR驗證

對比Day30自然全光照條件,紫葉稠李在經過30 d的遮光處理后,花青素合成通路上的關鍵酶PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT均呈現下調趨勢,花青素合成在遮光下受到了抑制,MYB6與MYB10呈表達上調趨勢(圖10),說明其對花色素苷合成途徑相關基因起到負調控的作用。

圖10 紫葉稠李花青素合成途徑關鍵基因的熒光定量分析Fig.10 The qRT-PCR verification of key genes in the anthocyanin synthesis pathway of Padus virginiana

3 結論與討論

孟祥春等[9]研究發現,非洲菊遮光后花色素的積聚減少,無法進行正常上色。PAL苯丙氨酸解氨酶是連接初生代謝與次生代謝途經的紐帶,是多酚類代謝的起始酶[10-11]。顧辰辰等[12]對茶樹短期遮光的影響研究表明,短期遮光處理對茶樹花色素苷代謝通路關鍵酶基因的表達影響很大,PAL、F3’H、DFR、UFGT出現下調現象。周波等[13]研究發現,草莓果實花色素苷的合成量受到光敏感度的影響,光不敏感草莓果實的花色素苷合成相關基因CHS、DFR、ANS遮光與不遮光表達沒有明顯差異,而光敏感草莓果實表達量受光部分要高于遮光部分。F3’H基因的上調會導致Penstemon barbatus花從藍色到紅色的變化[14],說明紫葉稠李葉片的花色素苷含量與其有密切關系,UFGT是花色素苷合成過程中最后一個酶,主要是在花色素苷合成后,對碳骨架起到糖基化修飾的作用[15],它能將不穩定的花色素苷進行糖基化,使其轉變為穩定的花色素苷。UFGT基因的表達與花色素苷含量變化趨勢相同,這一結果與蘋果、梨、葡萄中的報道一致[16-17]。

調節植物花色素苷代謝途徑的轉錄因子主要有MYB、bHLH和WD40,能與結構基因的啟動子結合,并影響花色素苷生物合成途徑中一個或多個結構基因的表達,從而改變花色素苷的代謝[18-19]。Yao等[20]研究發現,轉錄因子PyMYBll4和PyMYB10存在相互作用及功能疊加的效應,使花色素苷的生物合成得到加強。

本研究發現,遮光對紫葉稠李葉片淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成、植物激素信號轉導途徑影響不大,可能是植物適應環境并進行正常生長發育的必要生命代謝活動,氰氨基酸代謝途徑的富集說明植物啟動了自身的防御機制以抵抗病蟲害,另外,遮光也較顯著影響了類胡蘿卜素生物合成過程、α-亞麻酸的代謝過程,半萜類三萜類生物合成過程及玉米素合成過程。遮光對植物體內類黃酮生物合成有顯著影響,類黃酮是植物重要的一類次生代謝產物,花色素苷是類黃酮合成途徑的一個分支。本研究發現,遮光對紫葉稠李葉片的著色有顯著影響,并減少了葉片中的花色素苷合成,通過轉錄組測序分析發現,遮光與全日照條件下的差異基因主要富集在類黃酮生物合成代謝通路,進一步說明光照是紫葉稠李葉片著色和花色素苷代謝的關鍵因素之一,熒光定量分析顯示,遮光使花色素苷合成過程中的關鍵酶基因PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR、ANS、UFGT表達下調,關鍵轉錄因子MYB6、MYB10表達上調。