同源四倍體‘五月慢’的誘導鑒定

王紅堯,潘靜雯,周賀芳,徐園園,張蜀寧,侯喜林,劉同坤*

(1南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室/農業農村部華東地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室/南京農業大學園藝學院,南京 210095;2淮南市農業科學研究所,淮南 232001)

可育多倍體的形成可促進物種間的遺傳物質交流,豐富物種多樣性,為多倍體育種的發展奠定基礎[1]。“巨型性”是多倍體植物的特征之一,相較于二倍體植物,其品質明顯提升,適應性和抗逆性顯著增強[2]。約有75%的被子植物和95%的蕨類植物在進化過程中經歷過多倍化[3]。自然形成的多倍體大多是物種為適應環境,在長期的自然選擇中進化而來[4]。但自然誘變環境難于模擬,人工合成多倍體便是明晰植物進化歷史的極佳選擇[5]。

不結球白菜(Brassica campestrisssp.chinensisMakino)原產于中國,已有六千年以上的栽培歷史[6]。我國南方地區常稱其為青菜,北方地區稱其為油菜。我國同源四倍體不結球白菜的研究開始于1980年,劉惠吉等[7]誘導出同源四倍體‘矮腳黃’,發現其品質明顯高于二倍體植株。李艷艷[8]誘導出優質同源四倍體‘黃心烏’。王夏等[9]誘導出優質同源四倍體‘華鳳’。彭丹[10]誘導出耐熱同源四倍體‘夏帝’、‘烤青’。二倍體‘五月慢’種植面積較大,抽薹晚,解決了部分長江中下游地區“春淡季”市場不結球白菜緊缺問題,但是二倍體‘五月慢’抗性弱、產量低,遠不能滿足廣大消費者對葉菜類的需要[11]。本試驗用一定濃度的秋水仙素溶液誘導二倍體‘五月慢’,以期獲得高產、優質、晚抽薹的同源四倍體‘五月慢’材料,為不結球白菜多倍體育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以南京農業大學白菜系統生物學實驗室提供的二倍體‘五月慢’(2n=2x=20)為試驗材料,試驗地點為南京農業大學白菜系統生物學實驗室以及南京農業大學句容實驗基地。

1.2 誘導方法

‘五月慢’幼苗子葉完全展開時,參考前人[12-14]的方法,用質量濃度為0.2%的秋水仙素溶液點滴幼苗生長點,每天上午(9:00)和下午(17:00)各處理1次,每次滴50μL,共處理3 d。

1.3 鑒定方法

1.3.1 形態學觀察

觀察葉型、葉色、葉厚、花器官、種莢、種子等相關形態學性狀進行初步篩選,再通過解剖學方法觀察氣孔、花粉的形態特征等。

1.3.2 細胞學鑒定

將種子置于有濕潤試紙的培養皿中催芽,待其生根后取1—2 cm根尖,放入蒸餾水中,4℃條件下靜置24 h,卡諾固定液(無水酒精、冰醋酸體積比3∶1,現配)固定24 h,60℃條件下使用1 mol/L HCl解離4 min。采用壓片法制片,使用卡寶品紅染液(Solarbio)進行染色,在Olympus倒置顯微鏡(型號:IX73;生產商:奧林巴斯)100倍鏡下觀察染色體并拍照。

1.3.3 流式細胞儀倍性鑒定

利用流式細胞儀檢測植株DNA相對含量并進行分析鑒定。取0.1 g植株幼嫩葉片,在裝有1 mL提取液A(MgSO4緩沖液中加入1%PVP)的玻璃培養皿中快速切碎(冰上進行);過40μm濾篩后取濾液,5 000 r/min、4℃條件下離心5 min,棄上清液;加入1 mL提取液A,震蕩并重復前一步驟;加入500μL提取液B(MgSO4緩沖液中加入熒光染料和核糖核酸酶,現配),充分混勻后避光染色15 min,使用流式細胞儀(型號:cytoFLEX;生產商:貝克曼庫爾特)檢測。

1.4 二倍體和四倍體‘五月慢’營養品質分析以及農藝性狀調查

2018年10月播種,2019年3月8日進行品質及農藝性狀統計。二倍體和四倍體‘五月慢’植株各選取10株,取各植株同一部位的葉片,測定其硝態氮含量、可溶性蛋白含量、氨基酸含量、可溶性糖含量、纖維素含量、葉綠素濃度及花青苷含量[15],并測量株高、葉數、葉寬、柄寬、葉長、柄長、單株質量[16]等農藝性狀。

1.5 數據分析

采用Excel 2019軟件進行數據整理,使用SPSSStatistics 20軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 二倍體和四倍體‘五月慢’植株的形態學分析

由圖1可知,與二倍體‘五月慢’植株相比,四倍體‘五月慢’植株束腰明顯,葉片緊湊、開展度較小,葉色較深、葉面較褶皺;四倍體‘五月慢’花序花簇變大、花朵緊湊;花朵變大,單花花瓣更圓,顏色更加明艷,花器官個體較大;種莢變粗,種子直徑變大;花粉呈明顯棒狀,且可見少量梯形、圓形等不規則花粉;葉片下表皮氣孔密度變小、形態變大。

圖1 二倍體、四倍體‘五月慢’植株各器官Fig.1 Organs of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.2 二倍體和四倍體‘五月慢’植株細胞學分析

由圖2可知,根尖染色體鑒定結果顯示二倍體‘五月慢’的染色體數目為20,四倍體‘五月慢’根尖染色體數目為40。

圖2 二倍體、四倍體‘五月慢’細胞學鑒定Fig.2 The cytological identification of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.3 流式細胞儀倍性分析

由圖3可知,二倍體‘五月慢’的DNA相對含量在70左右。四倍體‘五月慢’的DNA相對含量在140左右,約為二倍體的2倍。

圖3 二倍體、四倍體‘五月慢’DNA相對含量Fig.3 DNA relative content of diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.4 二倍體和四倍體‘五月慢’營養品質分析

由表1可知,四倍體‘五月慢’植株中硝態氮含量、纖維素含量分別比二倍體降低了24.03%、31.84%,差異極顯著;可溶性蛋白含量、花青苷含量分別比二倍體增加了43.94%、37.08%,差異極顯著。相較于二倍體,四倍體植株葉綠素含量上升13.89%,可溶性糖含量上升9.76%,呈顯著差異;氨基酸含量上升14.33%,無顯著差異。

表1 二倍體、四倍體‘五月慢’營養品質比較Table 1 Comparison of nutritional quality between diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

2.5 二倍體和四倍體‘五月慢’農藝性狀分析

由表2可知,四倍體‘五月慢’植株株高、葉數、葉長、葉柄長分別比二倍體植株下降了4.78%、21.05%、4.14%、3.71%,且株高、葉柄長差異達極顯著水平;相較于二倍體植株,四倍體植株單株質量、十葉厚、葉寬、葉柄寬分別上升了22.63%、39.39%、2.85%、16.88%。

表2 二倍體、四倍體‘五月慢’主要農藝學性狀比較Table 2 Comparison of main agronomic traits between diploid and autotetraploid‘Wuyueman’

3 討論

染色體的同源倍數越多,細胞、細胞核的體積越大,葉片大小、厚度,氣孔和花粉粒大小,花和種子大小以及莖的粗度也隨之遞增,這種特征稱為多倍體的巨大性[17]。形態學鑒定方法直觀且操作簡便,可用于多倍體的初步鑒定。但形態學鑒定誤差大,結合細胞學及流式細胞儀鑒定可提高準確率。

與二倍體植物相比,多倍體植物通常表現出明顯的生長優勢,如生長迅速、適應性更強、組織器官更大等[18]。本研究顯示,相較于二倍體‘五月慢’,同源四倍體植株花簇、花朵、花器官、果莢、種子等均體現出巨大性,與張宇等[19]、王夏等[9]的研究結論一致,但株高等未明顯體現出此特性。

葉綠素是植物葉片中主要的光合色素,是植物進行光合作用的物質基礎,葉綠素含量是決定作物光合效率和生物量的重要因素[20]。本試驗中,四倍體‘五月慢’葉色深于二倍體,葉綠素總含量比二倍體植株高13.89%,可溶性糖含量增加9.76%。

葉類蔬菜中極易富集硝酸鹽,且人體內攝入的硝酸鹽80%以上來自蔬菜[21],雖然硝酸鹽對人體無直接危害,但是其在人體內可被還原成亞硝酸鹽,其與人體血紅蛋白結合會引發亞硝酸鹽中毒,還可能與次級胺反應生成致癌性亞硝酸胺[22-24]。本試驗中,四倍體‘五月慢’植株的硝酸鹽含量比二倍體‘五月慢’低。同源四倍體減數分裂行為異常是其育性降低的原因[25],本試驗中,同源四倍體‘五月慢’結種率下降,但種質仍然具有較好育性。

4 結論

本研究成功誘導出四倍體‘五月慢’,發現該四倍體具有束腰性強、植株矮化、葉色鮮亮、抽薹晚、產量高等優勢。且可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離氨基酸含量、葉綠素含量、花青苷含量較高,纖維素含量、硝酸鹽含量較低。