甘草堿溶性多糖超聲提取法的研究

唐世明

摘? ? 要：以NaOH濃度、料液比、提取時間、提取溫度為考察因素，通過單因素試驗確定各因素最佳水平。試驗結果表明，單因素試驗確定各因素最佳水平為NaOH濃度40 mg/mL、料液比1∶20（vol）、提取時間25 min、提取溫度45 ℃。

關鍵詞：甘草;堿溶性多糖;提取法

文章編號：1005-2690（2022）04-0025-03? ? ? ?中國圖書分類號：O657.5? ? ? ?文獻標志碼：B

甘草為多年生草本植物，其根莖具有藥用價值，有緩解咳嗽、清熱解毒、祛痰止咳、消炎等作用，有效成分是甘草酸、多糖和黃酮類化合物[1]。甘草多糖（GPS）具有毒性小、抵抗毒素、提高機體免疫力等優點[2]，提取方法涉及化學、物理、生物、醫藥等技術手段，包括傳統提取法、復合酶法、微波提取法、超聲提取法等。超聲提取法是在超聲場中極大的壓強下，使整個細胞壁破裂而釋放胞內物質，整個過程屬于物理變化，可保障胞內物質在一定時間內不發生任何變化，并且使用成本低、自動化率較高，可用于大規模的工業生產，同時避免了對環境和產品的污染[3]。目前，藥理活性研究主要集中在甘草黃酮、三萜類化合物（甘草酸）及甘草水溶性多糖上，而在甘草堿溶性多糖方面的研究報道比較少。本研究以超聲法提取甘草堿溶性多糖工藝參數，主要考察NaOH濃度（mg/mL）、料液比、提取時間（min）、提取溫度（℃）這4個因素對多糖提取率的影響，為確定超聲法提取甘草堿溶性多糖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

甘草購于和田市欣明維吾爾醫藥材交易市場，烘干粉碎。

1.1.2 試劑

石油醚（分析純）、無水乙醇（分析純）、正丁醇（分析純）、三氯甲烷（分析純）、丙酮（分析純）、濃硫酸（分析純）、苯酚（分析純）、NaOH（分析純）、葡萄糖（分析純）。

1.1.3 儀器

可見分光光度計722S（上海精密科學儀器有限公司制造），臺式離心機TDL—40B9（上海安亭科學儀器廠制造），數顯恒溫水浴鍋HH—Z（國華電器有限公司），超聲波清洗儀KQ-250DB（昆山市超聲波儀器有限責任公司）。

1.2 提取過程

對甘草進行清洗、烘干、粉碎處理。圓底燒瓶中稱取30 g粉末（加入180 mL石油醚）放入水浴鍋中（60～90 ℃）脫脂2 h，用180 mL 80%乙醇浸泡殘渣3 h，水浴（80 ℃）加熱1 h，過濾。提取液離心5 min（2 000 rpm），取上清，加入0.1%活性炭，水浴鍋（60 ℃）脫色20 min，離心5 min（2 000 rpm），取上清加入1.5倍體積的氯仿-正丁醇搖勻，靜置25 min后吸取上清液，加入95%乙醇靜置12 h，離心5 min（2 000 rpm）。去除上清，沉淀依次用無水乙醇、丙酮多次洗滌，60 ℃干燥。

1.3 甘草堿溶性多糖含量測定

量取甘草堿溶性多糖提取液1 mL于50 mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻;再精確量取此稀釋液溶液1 mL于10 mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻，將提取液稀釋500倍。精確量取稀釋后的溶液2 mL于試管中，滴加6%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置20 min，于490 nm處測定吸光度A值。利用葡萄糖作標準曲線[4]，再代入吸光度計算得到甘草堿溶性多糖含量。根據標準線的回歸方程計算樣液中多糖濃度（C），據式（1）、式（2）和式（3）計算出甘草堿溶性多糖的提取率及粗糖得率。

甘草堿溶性多糖的提取率=M2/M1×100%? ? ? ? （1）

M2=C×V×10-3=（A-b）/a×n×V? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（2）

甘草堿溶性多糖粗糖得率=M3/M1×100%? ? ? ? （3）

式中：M1為甘草干粉的質量（g）;M2為提取出的粗多糖質量（g）;M3為醇沉所得的粗多糖質量（g）;C為提取液的濃度（mg/L）;V為提取液體積（L）;A為吸光度;a為標準曲線的斜率;b為標準曲線在縱坐標上的截距;n為提取液的稀釋倍數。

2 試驗設計

分別對NaOH濃度、料液比、提取時間、提取溫度4個因素進行單因素試驗，以確定各因素的影響程度及適用范圍。

2.1 NaOH濃度對甘草堿溶性多糖提取的影響

稱取脫脂后甘草粉末2.0 g共4份，分別加入20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL NaOH溶液40 mL，在45 ℃下超聲提取25 min，提取1次，提取液處理后測定各濾液的總糖，并計算出多糖的提取率和多糖粗糖得率。

2.2 料液比對甘草堿溶性多糖提取的影響

稱取脫脂后甘草粉末2.0 g共4份，分別加入40 mg/mL NaOH溶液，其料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，在45 ℃下超聲提取25 min，提取1次，提取液處理后測定各濾液的總糖，并計算出多糖的提取率和多糖粗糖得率。

2.3 提取時間對甘草堿溶性多糖提取的影響

稱取脫脂后甘草粉末2.0 g共4份，分別加入40 mg/mL NaOH溶液40 mL，在45 ℃下分別超聲提取15 min、20 min、25 min、30min，提取1次，提取液處理后測定各濾液的總糖，并計算出多糖的提取率和多糖粗糖得率。749DCE71-6172-4D11-81F1-586C28A1D95A

2.4 提取溫度對甘草堿溶性多糖提取的影響

稱取脫脂后甘草粉末2.0 g共4份，分別加入40 mg/mL NaOH溶液40 mL，分別在40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃下超聲提取25 min，提取1次，提取液處理后測定各濾液的總糖，并計算出多糖的提取率和多糖粗糖得率。

3 結果與分析

3.1 NaOH濃度對甘草堿溶性多糖提取的影響

由圖1可知，NaOH濃度對甘草堿溶性多糖提取率、粗糖得率有一定影響，隨著NaOH濃度升高，甘草堿溶性多糖的提取率及粗糖得率也不斷升高，在水平3（40 mg/mL）時達到最大值，此后隨著NaOH濃度的升高，多糖提取率及粗糖得率反而下降。這可能是因為NaOH濃度的升高使pH值發生了變化，導致部分多糖的支鏈結構受到破壞，溶于堿的特性消失，目標產物的提取率及得率降低。因此，將NaOH濃度最佳水平確定為40 mg/mL。

3.2 料液比對甘草堿溶性多糖提取的影響

由圖2可知，料液比對甘草堿溶性多糖提取率、粗糖得率有一定影響，料液比達到水平2（1∶20）時，甘草堿溶性多糖提取率及粗糖得率均基本達到最大值，此后料液比重和多糖提取率及粗糖得率呈反比。

3.3 提取時間對甘草堿溶性多糖提取的影響

由圖3可知，提取時間對甘草堿溶性多糖提取率、粗糖得率有一定影響，提取時間在水平3（25 min）時多糖提取率、粗糖得率達到最大值，此后隨著時間延長，多糖提取率及粗糖得率反而下降。這與超聲波長時間的機械作用會破壞多糖結構有關。

3.4 提取溫度對甘草堿溶性多糖提取的影響

由圖4可知，隨著提取溫度升高，甘草堿溶性多糖的提取率及粗糖得率也不斷升高，在水平3（45 ℃）時達到最大值，此后隨著溫度升高，多糖提取率及其得率反而下降。這與多糖的熱不穩定性有關。

4 討論與結論

超聲波提取試驗中呈現了過程簡易、耗時短、提取率高的特點，達到了以盡量少的試驗達到較好結果的目的。

本試驗研究了超聲法提取甘草堿溶性多糖的主要條件，即NaOH濃度、料液比、提取時間、提取溫度。通過單因素試驗確定了甘草堿溶性多糖的最佳提取條件為NaOH濃度40 mg/mL、料液比1∶20（vol）、提取時間25 min、提取溫度45℃。然而，本試驗并未考慮到4個因素之間的交互作用，需要重新設計試驗。考慮到4個因素的2階以及所有的交互作用，應該選取更多因素水平設計試驗，選出試驗因素的最優理論值，再通過試驗驗證，檢驗優化條件下甘草堿溶性多糖的提取率及其粗糖得率是否與理論預測值接近。若與理論預測值接近，則說明所得到的回歸模型就是最終模型。若與理論預測值相差較大，則說明所得到的回歸模型并非最終模型，還需要重新設計試驗進一步研究。

參考文獻：

[1]王學宏.中藥多糖的免疫及抗腫瘤作用研究進展[J].齊魯醫學雜志，2000，15（3）：230-233.

[2]惠壽年，童阿玲.國內對甘草化學成分的研究進展[J].中藥學，1999，30（4）：313-315.

[3]劉霞，謝建新，李艷.甘草多糖的超聲提取及含量分析[J].西北藥學雜志，2004，19（2）：60-61.

[4]高麗娟，田曉燕.甘草殘渣中多糖的分光光度法測定[J].寧夏大學學報（自然科學版），2002，23（2）：182.749DCE71-6172-4D11-81F1-586C28A1D95A