石油降解菌ZS1對典型抗生素毒害作用的應激響應機制

劉蘇翔，高 宇，喬延路，薛建良

(山東科技大學安全與環境工程學院，山東 青島 266590)

環境中抗生素的污染及生態效應是近年來環境領域的研究熱點之一。對于大多數的抗生素來說，只有15%能夠被吸收，其余的將通過尿液和糞便排泄到自然生態系統中，造成環境污染、危害生物健康[1-4]，全球諸多自然水環境持續檢出抗生素的現狀，引起社會各界廣泛關注[5]。

本課題以近年來海洋環境抗生素污染為大背景，探究不同條件下，抗生素對海洋高效石油降解菌的抗氧化酶活性的影響。通過測定抗生素對降解菌的抑菌曲線及測定3種抗氧化酶SOD，POD，CAT的活性，考察抗生素對降解菌的毒性效應，為了解抗生素對環境污染高效降解菌的生態效應提供理論參考。

1 實 驗

1.1 試驗菌株

試驗所用菌株為一株從海水中分離出的高效石油降解菌，該菌株通過16SrRNA測序測定為銅綠假單胞菌(ZS1)。海水取自中國山東省青島市輸油管道爆炸油污海域(36.07°N，120.38°E)。

1.2 主要試劑及培養基

3種抗生素(OTC，EM，SDZ)，購自上海麥克林生化科技有限公司。試驗時，將3種抗生素分別用體積分數為0.1%的乙醇溶液(其對細菌CAT，POD，SOD活性測定的影響極微弱)逐級稀釋至所需濃度。LB培養基：蛋白胨質量濃度10 g/L，酵母粉質量濃度5 g/L，NaCl質量濃度5 g/L，pH 7.4。

1.3 試驗方法

(1)抗生素對ZS1的抑菌曲線的測定。將含ZS1的菌懸液在30 ℃、140 r/min下搖床培養24 h，使其處于對數生長期，將處于對數生長期的菌懸液用滅菌的LB培養基調整至所設計的濃度，加入配置好的抗生素溶液，使低濃度(μg/L級)抗生素系列終質量濃度為0.05，0.5，5，10，30，60，80 μg/L，高濃度(mg/L級)抗生素系列的終質量濃度為0.05，0.25，0.5，1，5，10，25，50 mg/L，同時設計溶劑對照組(含體積分數為0.1%乙醇的ZS1菌液)和空白對照組(含ZS1菌的LB培養基)，每組試驗重復3次。

(2)CAT酶活性的測定。通過紫外比色法[18]測定CAT的活性。定義吸光度(A240)變化0.01為一個CAT活性單位，通過紫外-可見分光光度計測定其在240 nm下的吸光度，每隔1 min讀數一次，共讀數3次。

(3)POD酶活性的測定。通過愈創木酚法[19]測定POD的活性。定義吸光度(A470)變化0.01為一個POD活性單位，通過紫外-可見分光光度計測定其在470 nm波長下的吸光度，每隔1 min讀數一次，共讀數3次。

(4)SOD酶活性的測定。通過氯化硝基四氮唑藍(NBT)法[20]測定SOD的活性。一個SOD活性單位定義為SOD抑制NBT光化學還原50%時的酶量，通過可見分光光度計于560 nm波長下測定吸光度，每組測定3個平行樣。

2 結果與討論

2.1 抗生素對ZS1的抑菌曲線

通過測量添加不同種類抗生素后ZS1的生長量，測定抗生素對ZS1的抑菌曲線。用抑菌曲線表示抗生素對ZS1生長量的抑制程度。不同濃度的OTC，EM，SDZ對ZS1的抑菌效果見圖1。

由圖1(a)和圖1(b)可以看出：在不同的OTC濃度下，隨著OTC濃度的增加，其對ZS1的抑制率明顯上升，有顯著的濃度-效應關系，但在OTC質量濃度低于0.5 μg/L時，ZS1的增殖能力不會受到明顯抑制；較高濃度的OTC在長期作用時抑菌效果更好，而較低濃度條件下OTC在短期內能對ZS1表現出較好的抑菌效果。具體來看，在高濃度情況下，48 h的抑制率最大達98.8%，48 h的抑菌率高于24 h的抑菌率，可能是因為接觸時間短，在此情況下OTC對ZS1活性的抑制來不及表現。在低濃度情況下，培養24 h時OTC對ZS1的抑制率高于培養48 h時，反映在較長時間的低濃度情況下，ZS1對OTC的抗藥性隨著培養天數的增加而增強。在實際環境中較低濃度的OTC在短期內能對ZS1表現出較好的抑菌效果，較高濃度的OTC則在長期作用時抑菌效果更好。整體來看，OTC濃度越大，其對ZS1的生長抑制作用越明顯[21]。

由圖1(c)和圖1(d)可以看出，ZS1對EM的耐受性比對OTC的耐受性好，EM在高濃度下的抑菌率最大為27.18%。具體來看，隨著EM濃度的增加，其對ZS1的生長抑制率均明顯上升，但低濃度條件下，抑制率變化幅度較小。當EM質量濃度低于5 μg/L時，ZS1增殖能力不會受到明顯抑制作用。研究表明，隨著時間延長EM的藥效會有一定程度的降低，在自然條件下EM的45 d降解率達到36.47%[22]。EM系列濃度作用48 h對ZS1的抑制率相對于作用24 h的數據同比降低，與ZS1對EM環境產生一定的適應性有關，且EM自身的緩慢降解也會影響藥性[23]。

由圖1(e)和圖1(f)可以看出，SDZ對ZS1的生長抑制率隨著濃度增加而增大，且由于ZS1對SDZ敏感性隨著時間的延長而降低，故培養48 h對ZS1的抑制率比培養24 h下降。單獨來看，高濃度條件下，SDZ對ZS1的最大抑制率達到16.47%。抑制效率隨濃度升高有明顯上升趨勢，同比對ZS1的生長抑制作用較低。張從良等[24]研究發現，隨著好氧降解進程的深入，經藥物處理后細菌菌落總數增加較快，驗證了SDZ對未滅菌湖水和豬場廢水中細菌菌落總數增長具有一定的促進作用。

圖1 3種抗生素對ZS1的抑菌效果培養時間，h：■—24； ■—48

綜上所述，不同種類的抗生素對ZS1的抑制效果不同，但整體來看，均是抗生素濃度越高，其對ZS1的生長抑制效果越明顯。

2.2 不同濃度抗生素的CAT酶活性

CAT是一類主要起催化底物氧化還原的酶，CAT能有效地清除各種活性氧基團，從而防止細胞膜系統的損壞[25]。通過紫外比色法對ZS1的CAT酶活性變化進行探討，不同濃度的3種抗生素影響下的CAT酶活性如圖2所示。

由圖2可以看出，在分別加入3種抗生素后，CAT酶活性均呈現先上升后下降的趨勢，表明在短時間接觸抗生素刺激下，細胞體內遭受氧化應激時，可以通過CAT酶活性的增加來減少細胞的氧化損傷[26]。這與Kuznaik和Sklodowska[27]分析番茄感染灰霉病后導致SOD、CAT酶活性增加的結論一致，表明最初的感染誘導了它們的活性，從而激活了植物抗氧化的防御。當CAT酶活性顯著低于對照組時，細胞內CAT酶的消耗與其產量之間不平衡，即活性氧積累過量，從而對細胞造成嚴重損傷。

從低濃度抗生素條件分析，如圖2(b)、圖2(d)和圖2(f)所示，與未受抗生素污染時的酶活性相比，添加OTC后CAT活性相對較高，其原因是抗生素的加入會給微生物帶來較大的氧化壓力，使微生物的呼吸作用增強，產生大量的H2O2，從而通過增加微生物中CAT酶活性來解除H2O2的毒害作用。當CAT酶活性均高于對照組時，通過CAT酶產量的增加來減輕活性氧對細胞的損傷，從而起到保護細胞的作用?？股氐姆N類以及污染時間也會對CAT酶活性產生一定的影響。

圖2 3種抗生素影響下的CAT酶活性培養時間，h：■—24； ■—48

2.3 不同濃度抗生素的POD酶活性

POD是一種活性較高的氧化還原保護酶[28]。通過愈創木酚法對抗生素存在條件下ZS1的POD酶活性進行探討，結果如圖3所示。

由圖3可以看出：添加OTC分別培養24 h和48 h時，POD酶活性均隨OTC濃度的增大而下降，高濃度OTC對ZS1的抗氧化酶有較強的破壞性；隨著OTC濃度的增加，細胞受脅迫程度加深，酶活性整體呈下降趨勢。在OTC質量濃度為0.05～1.00 mg/L的范圍內，48 h條件下酶活性較大，表明該濃度范圍內的OTC對ZS1具有一定的氧化作用，但不足以影響微生物產生更多的POD來清除體內的過氧化物。然而，當OTC質量濃度大于1 mg/L后，OTC作用時間的延長會進一步導致ZS1細胞的破壞，酶活性整體呈下降趨勢。添加EM培養48 h條件下，當EM質量濃度為0.5 mg/L時，POD酶的活性達到最高值。POD活性達到峰值時的濃度受抗生素種類所影響，POD對不同抗生素的耐受性不同。

圖3 3種抗生素影響下的POD酶活性培養時間，h：■—24； ■—48

2.4 不同濃度抗生素的SOD酶活性

SOD能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用[29]。采用NBT法對抗生素存在條件下ZS1的SOD酶活性進行探討，結果如圖4所示。

由圖4可以看出，與培養初期(時間0 h)相比，添加高濃度OTC后，體系的SOD酶活性顯著降低，表明抗生素的加入會產生較多的超氧化物，其氧化作用抑制微生物產生更多的SOD。低濃度OTC條件下，隨著培養時間延長，48 h時SOD酶活性有一定的上升，表明添加OTC后隨著培養時間的增長，ZS1對OTC產生了一定的適應性。

圖4 3種抗生素影響下的SOD酶活性培養時間，h：■—24； ■—48

高濃度EM條件下，SOD酶活性先有微弱增長趨勢，隨后活性下降。當酶活性低于對照組時，由于活性氧積累過量而對細胞造成損傷。在添加低濃度EM條件下，培養48 h后的SOD酶活性變化幅度較大，其原因是一定濃度下EM引起活性氧的積累，造成細菌過氧化損傷，而SOD酶通過消除活性氧來保護細胞，表明抗氧化酶參與了細胞內的解毒機制[30]。添加SDZ條件下，SOD酶活性變化幅度較小，說明濃度梯度不會影響SDZ對SOD酶合成的正常作用，不會明顯降低細菌的抗氧化、抗衰亡能力。

3 結 論

(1)抗生素濃度增加對ZS1生長的抑制作用明顯增強，呈顯著的濃度-效應關系。其中：培養24 h時OTC對ZS1的抑制效果弱于培養48 h時，可能是由于接觸時間太短，OTC還未充分發揮作用；低濃度條件下培養48 h時EM對ZS1的抑制率低于培養24 h的抑制率，與EM自身藥效隨時間降低會有一定關系；ZS1對SDZ的敏感性隨接觸時間的增加而降低。

(2)在不同抗生素污染條件下，CAT酶活性均有先上升后下降的趨勢，細胞遭受氧化應激時，均可以通過CAT酶活性的增加來減少細胞的氧化損傷。

(3)在抗生素污染條件下，隨著抗生物濃度增加，細胞受影響程度加深，POD酶活性整體呈下降趨勢；當抗生素質量濃度低于30 μg/L時，其對POD酶活性影響不大，說明在該濃度范圍環境中雖產生了一定的氧化作用，但不足以影響微生物產生更多的POD來清除體內的過氧化物。

(4)在抗生素污染條件下，SOD活性變化幅度較大，主要原因是活性氧積累造成細菌過氧化損傷，細菌通過SOD酶消除活性氧進而保護細胞；當抗生素濃度低于30 μg/L時，不會影響SOD酶合成的正常機制，不會降低細菌的抗氧化、抗衰亡能力。