姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及VEGF和NF-κB p65表達(dá)的抑制作用

項(xiàng) 彪，潘穎喆，謝安琪，程 希，鄧 玲

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一。DR導(dǎo)致視力下降甚至失明最主要的階段是增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。流行病學(xué)調(diào)查表明，DR診斷25a后，PDR的患病率接近50%，且大多數(shù)1型糖尿病(T1DM)患者將在大約10a后發(fā)展為PDR[1]，其病理學(xué)特征主要為晚期組織缺血缺氧，誘導(dǎo)多種促血管生成因子和炎癥因子的釋放增加，導(dǎo)致新生血管的形成，從而繼發(fā)玻璃體積血和視網(wǎng)膜脫離引起患者視力喪失[2]。在DR的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，VEGF和NF-κB起著非常關(guān)鍵的作用。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認(rèn)為是促進(jìn)血管生成的最主要因子，也是抗血管生成的重要靶點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體和纖維血管組織中的VEGF水平顯著高于正常眼[4]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種多向性核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與機(jī)體的免疫、炎癥等生理病理過(guò)程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，DR高血糖狀態(tài)可引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加，從而介導(dǎo)大量的炎癥因子釋放，而炎癥因子和ROS水平上調(diào)又可進(jìn)一步激活NF-κB，導(dǎo)致視網(wǎng)膜低度炎癥[6]。姜黃素(curcumin，Cur)是一種從姜科植物姜黃中提取的主要的多酚類(lèi)活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用，尤其在抗腫瘤方面具有較強(qiáng)的功效，能通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制腫瘤新生血管的形成[7-8]。研究還發(fā)現(xiàn)，姜黃素顯著降低脂質(zhì)過(guò)氧化，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑含量，調(diào)節(jié)抗氧化酶，并清除高血糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生[9]。但其對(duì)于高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCECs)是否也能通過(guò)降低VEGF、NF-κB的表達(dá)而發(fā)揮治療作用尚不明確。因此，本研究通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Western-blot及免疫細(xì)胞化學(xué)法，探討姜黃素對(duì)于高糖誘導(dǎo)的HRCECs作用的潛在機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料HRCECs(上海中科院細(xì)胞庫(kù))；低糖/高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；姜黃素、胰酶(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒(上海碧云天生物公司)；兔抗人VEGF多克隆抗體，兔抗人NF-κB多克隆抗體，兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子IgG，蛋白預(yù)染Marker，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(武漢博士德生物公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。本研究經(jīng)襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2方法

1.2.1姜黃素溶液的配置姜黃素，純度>95%，稱(chēng)取14.2mg姜黃素粉末溶解于1mL 100%的二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，根據(jù)C=m/M.V，配制成濃度為40mmol/L的姜黃素母液，除菌分裝后保存在-20℃冰箱中。臨用前，用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，DMSO終濃度<0.1%。

1.2.2細(xì)胞處理及分組將HRCECs置于含有青/鏈雙抗、胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：空白組(G0組，只含高糖DMEM培養(yǎng)基的調(diào)零組)，正常對(duì)照組(NG組，低糖DMEM培養(yǎng)基+細(xì)胞)，高糖對(duì)照組(HG組，高糖DMEM培養(yǎng)基+細(xì)胞)，G1組(高糖DMEM培養(yǎng)基+細(xì)胞+20μmol/L姜黃素)，G2組(高糖DMEM培養(yǎng)基+細(xì)胞+40μmol/L姜黃素)，G3組(高糖DMEM培養(yǎng)基+細(xì)胞+80μmol/L姜黃素)。正常糖濃度的DMEM培養(yǎng)基葡萄糖濃度為5.5mmol/L，統(tǒng)稱(chēng)為低糖培養(yǎng)基；高糖DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為25mmol/L；G0組僅設(shè)于CCK-8實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)HRCECs增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且長(zhǎng)勢(shì)良好的HRCECs用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌、胰酶消化、離心后，用DMEM培養(yǎng)基制成濃度為5×104cell/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔200μL將懸液接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。按照上述分組分別培養(yǎng)12、24、48h，向每孔加入CCK-8溶液10μL，37℃孵育4h后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(A值)，計(jì)算每組濃度復(fù)孔平均值及細(xì)胞增殖抑制率，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率(%)=[(對(duì)照組平均A值-加藥組平均A值)/(對(duì)照組平均A值-空白組平均A值)]×100%。

1.2.4Western-blot法檢測(cè)HRCECs中蛋白的表達(dá)收集各組處理24h后的HRCECs用PBS洗滌，加入適量的RIPA裂解液4℃下反應(yīng)20min以提取細(xì)胞總蛋白。加入1/5體積的5×蛋白上樣緩沖液，置于100℃沸水中10min。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。按照每孔50μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳。恒流300mA電轉(zhuǎn)90min后，用5%的脫脂牛奶室溫下封閉60min。然后分別加入經(jīng)TBST液稀釋的VEGF、NF-κB和β-actin一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1h。采用Image J軟件測(cè)定灰度值，計(jì)算A值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)HRCECs中蛋白的表達(dá)將預(yù)先消毒滅菌的蓋玻片放入6孔板內(nèi)，制備濃度為5.0×104cell/mL的單細(xì)胞懸液，每孔內(nèi)滴入2mL懸液，培養(yǎng)48h后棄液，按照分組加入不同的條件培養(yǎng)液，共5組：NG組、HG組、G1～G3組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后取出蓋玻片，用PBS洗滌、4%多聚甲醛室溫固定15min。再經(jīng)PBS洗滌，0.1%Triton-X100室溫通透化處理15min作染色前處理。然后在3%過(guò)氧化氫-甲醇溶液中浸泡30min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用PBS液洗滌后，再將其置于二抗來(lái)源的非免疫兔血清濕盒中封閉30min，去除血清后甩干；加入一抗(兔抗人VEGF 1∶200)，同時(shí)用PBS代替一抗設(shè)為陰性對(duì)照組，4℃濕盒中過(guò)夜，室溫下復(fù)溫30min，PBS液洗滌，加入生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育1h。最后，經(jīng)SABC法染色、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，干燥后顯微鏡下觀察。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算各組標(biāo)本灰度值：陽(yáng)性灰度值與背景灰度值之差。

2結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖能力的影響干預(yù)不同時(shí)間各組A450比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=687.00，F(xiàn)時(shí)間=179.50，F(xiàn)交互=26.74，均P<0.001)。與NG組相比，HG組中HRCECs增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.01)，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。增殖抑制率隨著藥物的濃度增加而上升，具有濃度依賴(lài)性。在相同藥物濃度作用下，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力減弱(P<0.01)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升，具有時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)果表明，高糖環(huán)境下的HRCECs增殖能力顯著增強(qiáng)，而姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖有明顯抑制作用，且隨著濃度的增加、干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)，見(jiàn)表1，圖1。

表1 不同濃度姜黃素作用不同時(shí)間后對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖的影響

圖1 不同濃度姜黃素作用不同時(shí)間后對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖抑制率的影響。

2.2Western-blot法檢測(cè)姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs中VEGF-A和NF-κBp65表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與NG組比較，HG組中VEGF-A、NF-κB p65的表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與HG組比較，G1～G3組中VEGF-A、NF-κB p65的表達(dá)均顯著下降(P<0.01)；在相同藥物濃度作用下，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達(dá)呈下降趨勢(shì)(P<0.01)；在相同干預(yù)時(shí)間下，HG組與G1～G3組之間兩兩比較，隨著姜黃素濃度增加，HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達(dá)呈下降趨勢(shì)(P<0.01)。結(jié)果表明，姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達(dá)具有下調(diào)作用，且在藥物濃度范圍內(nèi)呈劑量-時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)表2、3，圖2～4。

表2 高糖誘導(dǎo)的HRCECs經(jīng)不同濃度姜黃素干預(yù)12、24、48h后VEGF-A的表達(dá)

圖2 姜黃素作用12h后對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表達(dá)的影響。

圖3 姜黃素作用24h后對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表達(dá)的影響。

圖4 姜黃素作用48h后對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表達(dá)的影響。

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs中VEGF表達(dá)的影響VEGF的表達(dá)主要存在于HRCECs的細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中，陽(yáng)性表現(xiàn)為棕褐色顆粒著染。灰度值結(jié)果示，與NG組比較，HG組HRCECs中VEGF的表達(dá)明顯增多(P<0.01)。不同濃度姜黃素干預(yù)24h后與HG組比較，HRCECs中VEGF表達(dá)明顯減少(P<0.01)，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中的棕褐色陽(yáng)性著染逐漸減少，顏色變淡，不同濃度加藥組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明姜黃素能有效抑制HRCECs中VEGF的表達(dá)，且隨著藥物濃度增加抑制作用增強(qiáng)，上述結(jié)果與Western-blot結(jié)果相符，見(jiàn)表4、圖5。

圖5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs中VEGF表達(dá)的影響。

3討論

視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization ,RNV)是DR患者病情惡化、視力喪失的主要原因，其發(fā)生發(fā)展與HRCECs的增殖、VEGF及NF-κB表達(dá)上調(diào)之間關(guān)系密切。

表3 高糖誘導(dǎo)的HRCECs經(jīng)不同濃度姜黃素干預(yù)12、24、48h后NF-κB p65的表達(dá)

表4 姜黃素作用24h后各組HRCECs中VEGF的表達(dá)

新生血管的形成過(guò)程十分復(fù)雜，主要包括血管基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管四個(gè)階段。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高糖環(huán)境對(duì)不同組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞影響不同，對(duì)大血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表現(xiàn)為抑制其生長(zhǎng)，而對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞反而表現(xiàn)為促進(jìn)其增殖[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，高糖環(huán)境下，HRCECs的增殖能力顯著增強(qiáng)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符[11]；在給予不用濃度姜黃素干預(yù)后，可明顯降低HRCECs的增殖能力，且抑制作用隨著藥物濃度增加、干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。表明高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖能力增強(qiáng)，而姜黃素對(duì)其可有效抑制。

參與調(diào)控RNV形成的細(xì)胞因子眾多，血管生成因子(如VEGF)起刺激作用，血管抑素和色素上皮衍生因子(PEDF)起抑制作用[12]。正常環(huán)境下，各種因子保持動(dòng)態(tài)平衡。但在高血糖、氧化應(yīng)激及非感染性炎癥反應(yīng)等病理狀態(tài)時(shí)，平衡狀態(tài)會(huì)被破壞，促使血管生成的主要因子VEGF表達(dá)上調(diào)[13]。VEGF與其受體結(jié)合后，可激活下游的PI3K/Akt、p38及Raf等通路，來(lái)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)中Western-blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果均顯示，HG組細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量較NG組顯著增加，表明一定濃度范圍內(nèi)高糖環(huán)境可上調(diào)VEGF的表達(dá)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符[11]。姜黃素在抗新生血管形成方面的作用已經(jīng)得到了證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能通過(guò)調(diào)控VEGF信號(hào)通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和抑制血管生成，在結(jié)直腸癌的治療上發(fā)揮作用[8]。李勇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過(guò)降低VEGF的表達(dá)水平，抑制肝癌組織缺氧誘導(dǎo)的血管形成和肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度姜黃素處理高糖誘導(dǎo)的HRCECs后發(fā)現(xiàn)，加藥組細(xì)胞VEGF的表達(dá)顯著下降，且呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)合CCK-8結(jié)果，表明姜黃素抑制體外高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖可能與VEGF表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

NF-κB是一種關(guān)鍵的促炎轉(zhuǎn)錄因子，其信號(hào)通路的激活是DR炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵一步。在PDR患者中，高血糖介導(dǎo)的ROS生成增加、NF-κB激活與VEGF上調(diào)之間關(guān)系顯著[14]。研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ROS上調(diào)和非酶糖基化產(chǎn)物與其受體的結(jié)合，均能引起NF-κB的持續(xù)激活[6,15]。正常情況下，NF-κB在胞漿中與抑制蛋白(I-κB)結(jié)合處于失活狀態(tài)。當(dāng)受到刺激時(shí)，I-κB激酶發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致游離的NF-κB易位到細(xì)胞核，與特定的基因序列結(jié)合，誘導(dǎo)多種促炎因子、黏附因子、炎性酶、趨化因子等表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖和血管生成[5]，表明NF-κB的激活是始動(dòng)事件，隨后其他炎癥通路的激活逐步導(dǎo)致了DR微血管損傷。研究還發(fā)現(xiàn)NF-κB通路的激活能誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)[16]。姜黃素對(duì)NF-κB通路的抑制作用已在多種細(xì)胞中被報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能通過(guò)抑制I-κB激酶和NF-κB活性誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的KCL-22細(xì)胞凋亡[17]，其機(jī)制可能是由姜黃素自身的抗炎、抗氧化等藥理特性改變了細(xì)胞的微環(huán)境和對(duì)ROS水平的調(diào)控。本研究中Western-blot結(jié)果示HG組細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)量較NG組顯著增加，表明NF-κB通路在DR進(jìn)展過(guò)程發(fā)揮著重要作用，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符[11]。在給予不用濃度姜黃素干預(yù)后，加藥組細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)顯著下降，且呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)合CCK-8結(jié)果，表明姜黃素抑制體外高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖可能與NF-κB p65表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素能抑制高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖，其機(jī)制可能與其下調(diào)HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達(dá)有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)僅是體外實(shí)驗(yàn)，而且關(guān)于RNV的生成因素只考慮了VEGF和NF-κB，實(shí)際上DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，參與的細(xì)胞因子眾多，是多種因素相互作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)尚未明確姜黃素抑制VEGF、NF-κB表達(dá)的具體機(jī)制，及它們間的相互作用關(guān)系。姜黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCECs增殖及VEGF、NF-κB p65表達(dá)的抑制作用的具體機(jī)制等問(wèn)題有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。