參白方中總多糖與總皂苷提取工藝的研究

簡鳳嬌，李孝棟

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

據世界衛生組織統計，截至2019年，全球新增癌癥病例2 360 萬例，以化療為主的腫瘤治療過程中，骨髓抑制是最常見的毒副反應，而白細胞減少癥是骨髓抑制的突出表現［1-2］。臨床上，西醫治療白細胞減少癥的方法主要有口服或注射升白藥物、成分輸血以及胚胎干細胞移植等，短期療效確切，但常伴有不良反應且費用昂貴［3-4］。中藥具有多靶點、長效、毒副作用小的優勢，但存在使用周期長、見效慢的缺點，而由有效部位組成的中藥制劑可提高中藥的治療效果［5］。本研究中的參白方出自譚支紹教授主編的《藥用寄生》，方中取銀耳12 g、絞股藍45 g、黃芪和黨參各30 g 用清水共煎煮，長期服用可防治癌癥放化療導致的白細胞減少癥［6］。參白方的傳統提取工藝雖然簡單，但有效成分提取不完全，起效慢。通過前期文獻查閱與預實驗［7-10］，表明總多糖與總皂苷是參白方的主要有效部位。故本研究先采用水提醇沉的方法提取參白方中銀耳、黃芪和黨參中的總多糖，再將藥渣與絞股藍合并，先乙醇回流提取后再用水飽和正丁醇萃取獲得總皂苷。以總多糖和總皂苷的提取率及含量作為正交優化總多糖和總皂苷的提取工藝的評價指標，為參白方的制劑研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-9600 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；AR-2140 十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥 乙醇（湖南湘易康制藥有限公司，批號：100320170322）；香草醛（北京市芳草醫藥化工研制公司，批號：860718）；人參皂苷Rg1對照品（批號：110703201933，純度≥98.0%）、D-無水葡萄糖對照品（批號：110833200302，純度≥98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；分析純冰醋酸（批號：2102191）、正丁醇（批號：1601011）、苯酚（批號：171116）均購自西隴科學股份有限公司；甲醇（批號：20190320）、高氯酸（批號：10076732）、濃硫酸（批號：20201222）均購自國藥集團化學試劑有限公司。黃芪、絞股藍、銀耳、黨參均購自福州閩侯上街致誠藥店，經福建中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定為合格藥材，符合2020年版《中華人民共和國藥典》規定。

2 方法與結果

2.1 總多糖含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取銀耳2.0 g、黃芪和黨參各 5.0 g，浸泡 30 min，加入 25 倍水煎煮 3次，每次4 h，過濾，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL；加入4 倍量95%乙醇，靜置過夜，過濾，濾餅干燥即得總多糖粗品；精密稱取總多糖粗品5.06 mg 于50 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即得每1 mL 含0.101 mg 總多糖的供試品溶液，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取D-無水葡萄糖對照品25.13 mg 于25 mL 量瓶中，加蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，即得每1 mL 含1.005 mg 的D-無水葡萄糖對照品溶液，備用。

2.1.3 線性關系考察 分別精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 10 mL 量瓶中，加入新配的5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再加入濃硫酸5 mL，沸水浴加熱15 min 后，取出，置冰水浴冷卻10 min，用紫外可見分光光度計于490 nm波長處測定吸光度值，隨行空白。以對照品濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y＝8.45x＋7.92×10-2，r＝0.998 3。結果表明：D-無水葡萄糖在0.010 0～0.060 3 mg/mL 濃度范圍與吸光度值呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 量取同一份對照品溶液，按“2.1.3”項下方法，重復測定吸光度值6次。測得吸光度的平均值為0.450，RSD為0.86%，結果表明該儀器精密度良好。

2.1.5 重復性考察 分別制備6 份供試品溶液，按“2.1.3”項下方法平行測定吸光度值，計算供試品溶液中總多糖平均含量為43.114%，RSD為0.62%，結果表明該方法的重復性良好。

2.1.6 穩定性考察 量取同一份供試品溶液，按“2.1.3”項下方法，分別在0、15、30、45、60、90、120 min時測定吸光度值。測得吸光度平均值為0.431，RSD為1.08%，結果表明供試品溶液在2 h 內穩定。

2.1.7 加樣回收率實驗 精密量取6 份已知含量的供試品溶液各0.5 mL，分別加入對照品溶液各20 μL，按“2.1.3”項下方法測定吸光度值。結果見表1，表明該方法準確度良好。

表1 加樣回收率實驗結果

2.2 總皂苷含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取絞股藍7.5 g，合并多糖提取濾渣，加入8倍量由“2.1.1”項下所得醇沉液配制的80%乙醇，浸泡30 min，提取2 h，過濾；濾渣再加入8 倍量80%乙醇，同法提取，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL；每次加入3 倍量水飽和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得總皂苷粗品；將所得總皂苷粗品適量溶于25 mL量瓶中，加入蒸餾水稀釋至刻度，即得每1 mL 含1 mg 的總皂苷的供試品溶液，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對照品10.04 mg 置于25 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，稀釋至刻度，即得每1 mL 含0.402 mg 的人參皂苷Rg1對照品溶液，備用。

2.2.3 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于10 mL 量瓶中，100℃水浴揮干后，冷卻，加入新配的5%香草醛溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴加熱15 min，取出，立即用冰水冷卻，精密加入冰醋酸5 mL 后，用紫外分光光度計于550 nm 波長下測定吸光度值，隨行空白。以對照品濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y＝1.01×10-2x－1.02×10-2，r＝0.999 1。結果表明：人參皂苷Rg1 在0.016 1～0.064 3 mg/mL 濃度范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 量取同一份對照品溶液，按“2.2.3”項下方法，重復測定吸光度值6次。測得吸光度的平均值為0.393，RSD為0.45%，結果表明該儀器精密度良好。

2.2.5 重復性考察 分別制備6 份供試品溶液，按“2.2.3”項下方法平行測定吸光度值，計算供試品溶液中總皂苷平均含量為33.639%，RSD為0.28%，結果表明該方法的重復性良好。

2.2.6 穩定性考察 量取同一份供試品溶液，按“2.2.3”項下方法，分別于0、15、30、45、60、90、120 min時測定吸光度值。測得吸光度平均值為0.287，RSD為1.06%，結果表明供試品溶液在2 h 內穩定。

2.2.7 加樣回收率實驗 精密量取6 份已知含量的供試品溶液各1.5 mL，分別加入人參皂苷Rg1對照品溶液各0.1 mL，按“2.2.3”項下方法測定吸光度值。結果見表2，表明該方法準確度良好。

表2 加樣回收率實驗結果

2.3 正交優化試驗

2.3.1 總多糖提取的正交試驗 參考相關文獻與預實驗結果，選取提取時間（A）、提取次數（B）、料液比（C）為考察因素，平行操作條件下，以總多糖的提取率與含量為評價指標，按L9（34）正交表設計實驗，見表3。分別稱取9 份銀耳2.0 g，黨參、黃芪各5.0 g，根據正交因素水平表，按“2.1.1”項下方法提取得總多糖粗品。精密量取0.1 mg/mL 總多糖溶液1 mL，按“2.1.3”項下方法，測定總多糖的吸光度值，并計算總多糖含量。結果見表4～表5。

表3 總多糖提取的正交試驗因素水平表

表4 總多糖提取的正交試驗結果

表5 總多糖提取的正交試驗方差分析表

由表5 方差分析可知：提取時間、提取次數、料液比對總多糖含量影響均不顯著（P＞0.05），選擇的3 個因素對實驗結果的影響，由大到小為A＞B＞C，總多糖的優選提取工藝條件為A3B3C2，即料液比為1∶20，提取3次，每次4 h，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL，加入4 倍量95%乙醇，靜置過夜，過濾，濾餅干燥即得總多糖粗品。

2.3.2 總皂苷提取的正交試驗 根據相關資料與預實驗結果，選取提取時間（A）、提取次數（B）、乙醇濃度（C）、料液比（D）為考察因素，平行操作條件下，以總皂苷的提取率與含量為評價指標，按L9（34）正交表設計實驗，見表6。分別稱取9份絞股藍7.5 g，根據正交因素水平表，按“2.2.1”項下方法提取得總皂苷粗品。精密量取1 mg/mL 總皂苷溶液1 mL，按“2.2.3”項下方法，測定吸光度值并計算總皂苷含量。結果見表7～表8。由方差分析可知：提取時間、提取次數、乙醇濃度、料液比對總皂苷含量影響均不顯著（P＞0.05），選擇的4個因素對實驗結果的影響，由大到小為B＞C＞D＞A，總皂苷的最佳提取工藝條件為A3B2C2D1，即料液比為1∶8，用80%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g/mL，每次加入3 倍量水飽和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得總皂苷粗品。

表6 總皂苷提取的正交試驗因素水平表

表7 總皂苷提取的正交試驗結果

表8 總皂苷提取的正交試驗方差分析表

2.4 工藝驗證 分別稱取3 份與正交試驗相同批次的各個藥材，分別按“2.3.1 ”與“2.3.2 ”項下方法提取總多糖粗品與總皂苷粗品，并計算其提取率與含量。結果見表9～表10。

表9 總多糖最優提取工藝驗證結果

表10 總皂苷最優提取工藝驗證結果

所得結果與正交試驗結果最大值比較，相差不大，由此可判斷，優選的工藝可行、穩定。

3 討 論

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，但因其成分眾多、復雜，也造成了中藥制劑服用量大，起效慢，故分離純化中藥有效成分或部位，減量增效是中藥現代化開發的有效思路之一。通過文獻的查閱，對參白方中各藥味有效部位的分析，結合前期藥效預實驗，表明參白方中總多糖和總皂苷具有升高白細胞水平的作用，故本實驗對參白方中總多糖和總皂苷的提取進行工藝優化研究。傳統中藥復方的提取液中成分眾多，給有效成分的分離純化帶來諸多不便。而本實驗在提取階段便分離出所需的有效部位粗品，為后期進一步純化處理奠定基礎。

參白方中提取的總多糖為粗多糖，硫酸能夠將多糖先水解為單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，并與苯酚生成橙黃色化合物，采用硫酸-苯酚法能夠準確測定總多糖的含量，同時可以避免粗總多糖中蛋白的影響，且顯色較為穩定［11］。結合文獻以及2020 版《中華人民共和國藥典》對多糖的含量測定，以D-無水葡萄糖作為指標成分。參白方中提取的總皂苷主要以絞股藍皂苷為主，而人參皂苷Rg1是絞股藍皂苷中具有升高白細胞水平作用的主要成分之一［12］，故以人參皂苷Rg1為總皂苷含量測定的指標成分。

總多糖與總皂苷提取的正交試驗設計以含量和提取率為評分指標，通過查閱文獻，設計綜合評分權重為含量占比70%，提取率占比30%。主要考慮到本實驗提取的總多糖和總皂苷為粗品，其含量能反映該提取工藝對后期分離純化的影響；同時以提取率作為輔助指標，能全面反映提取工藝的優劣。在前期的單因素實驗中，分別考察了提取時間（1、2、3、4、5 h）、提取次數（1、2、3、4、5次）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對銀耳、黃芪和黨參中總多糖提取的影響，結果表明：隨著提取時間、提取次數和料液比的增加，總多糖的得率及含量逐漸增加，分別在提取4 h、提取3次和料液比為1∶25 時達到峰值，而提取 3 h 和 5 h 對總多糖提取的影響相當，考慮時間成本，設計正交試驗優化的因素和水平。同樣，分別考察了提取時間（1、2、3、4、5 h）、提取次數（1、2、3、4、5次）、料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14）和乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對參白方中總皂苷回流提取的影響，結果表明：分別在提取2次和料液比為1∶10 之后，總皂苷的提取率在逐漸下降，而提取2 h 和乙醇濃度為80%時，最有利于總皂苷的提取，故設計正交試驗優化總皂苷提取的因素和水平。

總皂苷提取工藝優化結果表明：回流提取次數對總皂苷的提取影響較大，提取時間與料液比影響較小，如果考慮到節約試劑和時間成本，可以適當調整提取時間和料液比。從本次正交試驗中可以發現：總多糖的提取率達到15%，總皂苷提取率可達12%，含量為30%～50%，可根據需要考慮是否進一步純化，以提高總多糖與總皂苷的含量。本實驗對參白方中多個有效部位提取工藝的優化能為中藥復方的提取工藝提供有益啟示，也為中藥制劑的進一步開發奠定基礎。