基于PERK通路探討榮筋拈痛方對軟骨細胞內質網應激反應抑制作用

付長龍 ，謝新宇 ，何俊君 ，邱志偉 ，鄭春松 ，葉錦霞 ，馬德尊 *

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學雜志社，福建 福州 350122）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）嚴重危害中老年人群的生命健康，關節軟骨漸進性退變是導致 KOA 的關鍵病因［1-2］。臨床中 KOA 患者常伴有患處關節的反復疼痛、屈伸活動不利等癥狀，病情進展至疾病后期還可出現關節活動受限乃至致殘［3-4］，因此，延緩關節軟骨細胞退變，防止病情進一步發展，是治療KOA 的重要舉措。研究發現PERK 信號通路介導的軟骨細胞內質網應激（ERS）是影響KOA 軟骨退變的重要環節之一［5-6］，但從miRNA-377-3p 調控PERK 信號通路關聯的內質網降解增強子（EDEM1）、蛋白激酶R 樣內質網激酶（PERK）、轉錄激活子4（ATF4）、免疫球蛋白重鏈結合蛋白（BIP）與 DNA 損傷誘導基因 153（GADD 153）角度，探討榮筋拈痛方（RJNTD）延緩 KOA 軟骨細胞退變的作用機制尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 毒胡蘿卜素（TG，美國Sigma公司，批號：0000120608）；顯影超敏試劑盒（中國亞科因生物技術有限公司，批號：ATTAU1101）；EDEM1（批號：00041108）、PERK（批號：00088211）、Ⅱ型膠原組化抗體（批號：00010731）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；即用型免疫組化試劑盒（福州市邁新生物技術開發有限公司，批號：1908219706C）；ATF4（批號：9N29）、BIP（批號：9N29）、GADD153（批號：4612）、GAPDH（批號：9306）均購自美國SAB 公司；通用型高靈敏度染料法定量PCR 檢測試劑盒（中國諾唯贊生物技術有限公司，批號：7E570A1）；Nano?Drope 2000 微量紫外分光光度計（賽默飛世爾科技中國有限公司）；CFX96 熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；引物設計與合成：miRNA-377-3p（上游：CCGCGATCACACAAAGGCAAC，下游：AGTGC AGGGTCCGAGGTATT）、U6（上游：CTCGCTTCGGC AGCACATATACT，下游：ACGCTTCACGAATTTGCG TGTC）均購自福州尚亞生物技術有限公司。

1.2 藥物 榮筋拈痛方凍干粉購自江陰天江藥業有限公司，生產批號：2006001，藥物安全性及質量控制檢測均已完成。

1.3 實驗動物 健康SPF 級雄性C57BL/6 小鼠30只，4周齡，體質量（15±3）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。清潔級醫學實驗動物環境設施由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。實驗動物按標準飼料喂養，自由飲水。實驗過程及方法均符合福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求。

2 實驗方法

2.1 軟骨細胞培養、鑒定 小鼠經5.0%異氟醚麻醉下處死，無菌條件下體外分離雙膝軟骨，PBS 洗滌3次，隨后經0.2%Ⅱ型膠原酶消化獲得原代軟骨細胞。原代軟骨細胞培養到第9天后進行傳代培養，獲得一代軟骨細胞。按照前期研究基礎對一代軟骨細胞進行Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色鑒定［7］，在無菌玻片上用4%多聚甲醛固定細胞，加入軟骨素酶 ABC 后室溫孵育 30 min，PBS 漂洗，5 min/次，共3次，加入5% BSA 室溫孵育30 min。加入Ⅱ型膠原組化抗體反應30 min，PBS 洗滌后在50 μL DAB 浸潤10 min；依次經過蘇木素復染、沖洗與反藍，最后對標本進行晾干、脫水、封片和顯色拍照。觀察到細胞核出現藍染，其胞漿區呈現棕黃色，表明提取的細胞為軟骨細胞，無雜質細胞，純度良好。

2.2 實驗分組及干預措施 將軟骨細胞以20萬/孔接種于6 孔板中，用含10%胎牛血清低糖DMEM 培養液置于5%CO2培養箱中常規培養。將細胞隨機分成空白組、對照組、模型組和中藥組，細胞匯合至80%時開始干預。空白組常規培養4 h，對照組常規培養4 h 后更換300 μg/mL RJNTD 培養液培養12 h，模型組用 25 μmol/L TG 培養液培養 4 h 后改為常規培養，中藥組用25 μmol/L TG 培養液培養4 h 后更換300 μg/mL RJNTD 培養液培養12 h。

2.3 Real-time PCR 檢 測 miRNA-377-3p 相 對 表 達水平 各組干預后采用Trizol 法提取軟骨細胞中的總RNA；微量紫外分光光度計檢測各組樣本RNA濃度，并檢測260 nm 與280 nm 處吸光度，計算比值。采用莖環法反轉錄miRNA。根據反轉錄試劑盒說明書，取1μg 總RNA 反轉錄成cDNA，反轉錄條件：55℃ 15 min，85℃ 5 s。以 1 μL cDNA 為模板擴增miRNA-377-3p。擴增反應條件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 個循環。以 U6 為內參照基因，計算各目的基因 2-??Ct，比較分析 miRNA-377-3p相對表達水平。

2.4 Western blot 檢測軟骨細胞中 EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表達水平 干預后提取各組軟骨細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白定量，配制12%分離膠和5% 濃縮膠，上樣后進行電泳，采用半干法轉膜，封閉液封閉2 h 后洗膜，再將各條膜放入預先配置好的EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD 153 的一抗后，置于4 ?C 冰箱搖床過夜充分震蕩反應，待二抗反應處理后，使用ECL 發光液進行顯影，于凝膠成像儀下曝光成像，后分析儲存。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0 軟件對實驗數據進行處理。計量資料符合正態分布采用（）表示，采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 各組miRNA-377-3p 相對表達水平比較 見圖1。

圖1 各組miRNA-377-3p 相對表達水平比較圖

3.2 各組 EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表達水平比較 見圖2。

圖2 各組EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表達水平比較圖

4 討 論

KOA 以“膝骨痹”特征起病，其主要病機為肝腎虧虛為本，風寒濕邪為標［8］，治當補肝腎、祛風濕。榮筋拈痛方具有補肝腎、祛風濕、除痹痛之功，臨床治療KOA 具有良效［9］。課題組前期研究證實：榮筋拈痛方可促進軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白表達，并促進軟骨細胞增殖，進而延緩軟骨細胞退變［10］。

關節軟骨漸進性退變是KOA 的關鍵病因，而關節軟骨細胞發生內質網應激反應（ERS）與KOA軟骨退變密切相關［11］。研究發現：KOA 發生后，miRNA-377-3p 在KOA 相關組織中表達呈降低趨勢［12］，且在軟骨細胞中過表達 miR-377-3p 可促進軟骨細胞增殖，降低炎癥反應，并減輕軟骨細胞退變程度［13］。內質網應激發生后，與BiP 解離的PERK 寡聚后發生磷酸化，可促進ATF4 表達，上調EDEM1 與GADD153 表達，最終促使軟骨細胞凋亡發生［14-16］。前期我們通過StarBase 數據庫檢索篩選基因結合位點，發現miR-377-3p 與EDEM1 具有結合位點。EDEM1 作為內質網應激中的重要基因，可促進蛋白質降解從而緩解內質網應激反應［17-18］，推測miRNA-377-3p 可調控PERK 信號轉導通路，且是影響KOA 軟骨退變的重要環節［19-20］。

本研究實驗結果顯示：榮筋拈痛方干預TG 誘導的軟骨細胞后，細胞中miR-377-3p 基因表達上調，內質網應激反應PERK 信號通路相關蛋白EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 異常增高的蛋白表達水平下降，表明榮筋拈痛方可以有效緩解軟骨細胞內質網應激，發揮延緩軟骨退變的作用，其機制可能與miR-377-3p 調控內質網應激相關蛋白有關。