氮磷鉀復合肥與促生菌Bacillus sp. KTS-1-1配施對太子參生理特性、生物量及品質的影響

焦松林 任建國 歐陽湖 倪顯春 田茂松 王俊麗

（貴州醫科大學公共衛生學院/環境污染與疾病監控教育部重點實驗室/貴州省食品營養與健康工程研究中心，550025，貴州貴陽）

在農業生產中，化學肥料的施用常被認為是促進作物增產豐收的主要途徑。但研究[1-2]證實，化學肥料使用效率通常較低，僅部分營養元素能被植物吸收利用，且長期多次施用（尤指氮肥、磷肥）極易使土壤 pH和可交換堿含量降低，致使土壤養分流失和生產力下降（即土壤退化）。此外，長期過度施用化學肥料產生的化學污染物（如硝酸鹽、一氧化二氮）還會通過遷移、轉化等途徑進入水體和大氣等，引發一系列環境問題，嚴重危害人體健康[3]。因此，在不危及土壤資源及環境的同時，如何促進作物增產是當今農業領域面臨的一項重大難題。而植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）所具有的多重生物功能使其變得可能。研究[4]顯示，PGPR能通過生物固氮、溶解礦質養分、調控嗜鐵素和生長素產生水平、誘導植物系統抗性等多種促生效應，替代化學肥料改善土壤肥力、促進植物生長及加強病蟲害防治。近年來，PGPR在不少作物上的應用研究多有報道。Habibi等[5]對從水稻根系分離的98種PGPR菌株促生效應研究發現，89.7%的菌株能產生生長素，54.0%表現出固氮酶活性，40%表現出溶磷及嗜鐵素分泌功能，通過水稻生長試驗進一步發現，超過 70%的接種菌株能明顯提高水稻根和苗的干重。婁義等[6]研究發現，芽孢桿菌（Bacillus）Bs10、Ba12和Bl10能明顯促進番茄根系生長，增加番茄土壤微生物區系優勢菌甲基營養型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）數量，降低病原真菌腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）在根區和根表土壤中定殖。朱忠彬等[7]研究發現，短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3能誘導增強煙葉過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和超氧化物歧化酶（SOD）等自身免疫防御酶活性，提高煙草抗病能力。因此，有望將PGPR應用于當今生態農業的發展中。

太子參（Pseudostellaria heterophylla）是一味臨床常用中藥材，富含多糖、皂苷、氨基酸、礦質元素等多種活性成分，在免疫調節、鎮咳、抗疲勞、保護視網膜和治療糖尿病等方面都有重要的藥理作用[8-10]。近年來，隨著野生資源銳減，為滿足臨床用藥需求，人工生產逐漸成為主流。但人工生產中化肥及農藥的長期施用會導致連作障礙發生，進而影響到太子參產量及品質，故探尋其他類型肥料替代或部分替代傳統化肥施用迫在眉睫。為此本研究利用前期從太子參根際分離的一株具有抗根腐病菌、溶無機磷及解鉀功能的芽孢桿菌KTS-1-1制備微生物肥料，并用于太子參盆栽試驗，探討其對太子參生產狀況的影響。考慮到實際生產中，單獨施用PGPR往往不能滿足植物生長對營養的需要[11-12]，本試驗在促生菌 KTS-1-1的基礎上增施一定比例的氮磷鉀復合肥，探究不同比例氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1配施對太子參生理特性、生物量及品質的影響，為太子參產業可持續發展提供理論依據及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

太子參品種為‘三泓 1號’，購自貴州省施秉縣三泓藥業有限公司。氮磷鉀復合肥（總養分＞48%，氮:磷:鉀=15:18:15）購自貴州開磷（集團）有限責任公司。促生菌KTS-1-1菌株由課題前期獲取[13]，經牛肉膏蛋白胨培養基（牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，pH 7.0～7.2）涂布培養后稀釋成含活菌濃度約 3×108CFU/mL的菌懸液。土壤基本理化指標為pH 7.56、有機質12.81g/kg、有效氮 114.92mg/kg、有效磷 12.79mg/kg、有效鉀131.64mg/kg、電導率0.28mS/cm。

1.2 試驗設計

盆栽試驗時間為2017年12月至2018年7月。采用隨機區組排列，共設6個處理（表1），每個處理3次重復，每次重復10盆。篩選健康、無病、大小一致的太子參塊根作為種子進行盆栽種植（盆高40cm，直徑35cm），稱取15kg土壤，添加2.0g尿素，1.5g鈣肥，混勻后裝盆，每盆放10個太子參塊根后用5kg土壤將其覆蓋。太子參種植后期按常規管理，分別在太子參初花期、盛花期和花后期對各處理地上部追施（噴施）200mL處理液，成熟期采集太子參植株于-80℃冰箱保存待測。種植期間根據土壤狀況適當補充自來水，每盆每次補水300mL，以保證土壤濕潤。

表1 氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1(3×108 CFU/mL)施用方案設計Table 1 The scheme design on the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 (3×108 CFU/mL)

1.3 測試項目及方法

1.3.1 生理特性 成熟期隨機采取各處理組的太子參植株30株（每個重復10株）。蒸餾水沖洗葉片，塊根去掉塵埃、土壤顆粒，常溫自然晾干，液氮研磨后在-80℃冰箱保存待測。分別采用凱氏定氮法、鉬藍法及火焰光度法測定葉片氮、磷和鉀營養元素含量，采用試劑盒（南京建成生物公司）測定葉片CAT、SOD、PAL和POD防御酶活性。

1.3.2 生物量 樣品采集同1.3.1，30株植株經蒸餾水清洗，常溫晾干后，按常規方法測定株高、塊根鮮重。采用葉面積儀（GDY-500M，江蘇連云港金升科技有限公司）測定平均葉面積。塊根在70℃烘干至恒重，測定干重。

1.3.3 塊根品質 取適量在-80℃冰箱保存的待測塊根進行品質測定，參照秦民堅等[14]的方法，采用硫酸―苯酚法測定塊根多糖含量。用香草醛―冰醋酸法測定塊根皂苷含量。采用試劑盒（南京建成生物公司）測定塊根氨基酸含量。用原子吸光光譜法[15]測定塊根鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅和鈷元素含量。

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2016和Origin 8.0軟件進行數據處理及繪圖，SPSS 25.0對數據進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 氮磷鉀復合肥與促生菌 KTS-1-1配施對太子參生理特性的影響

2.1.1 對葉片營養元素含量的影響 由圖1可看出，與CK處理相比，T1～T5處理均能不同程度地提高葉片氮、磷、鉀營養元素含量。與T1處理相比，T2和T3處理葉片氮含量、T5處理葉片鉀含量顯著降低，而T4處理葉片氮、磷、鉀含量分別顯著增加了12.27%、32.81%和37.80%。復合肥與促生菌配施處理（T3、T4、T5）之間，T4處理葉片氮、磷、鉀含量較其他處理有所升高，其氮、磷、鉀含量較 T3處理顯著增加了 31.35%、18.06%和36.97%，氮和鉀含量較T5處理顯著增加了11.57%和50.27%。由此可見，減量75.0%的氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1配施（T4）更有利于葉片氮、磷、鉀營養元素的吸收。

圖1 氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參葉片營養元素含量的影響Fig.1 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on nutrient elements content in leaves of P.heterophylla

2.1.2 對葉片防御酶活性的影響 由圖2可知，相比T1處理，T2和T3處理CAT活性分別顯著提高了37.18%和37.37%，但與CK、T4和T5處理相比無顯著性差異（P＞0.05）。在葉片 SOD、PAL及POD活性方面，T2、T3、T4處理相比CK和T1處理均顯著提高，T2處理較 CK處理分別提高了51.24%、14.48%和3.36%，較T1處理分別提高了22.67%、27.86%和7.00%；T3處理較CK處理分別提高了24.78%、10.81%和40.89%，較T1處理分別提高了1.21%、23.76%和45.85%；T4處理較CK處理分別提高了50.20%、19.72%和40.24%，較T1處理分別提高了21.83%、33.71%和45.19%。T5處理相比T1處理，SOD和POD活性分別顯著降低了7.30%和13.86%，而PAL活性則顯著提高了6.89%，與T2、T3和T4處理相比，T5處理葉片的SOD、PAL及POD活性均顯著降低，較T2處理分別降低了24.43%、16.40%和19.50%，較T3處理分別降低了8.40%、13.64%和40.94%，較T4處理分別降低了23.91%、20.06%和40.67%。

圖2 氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參葉片防御酶活性的影響Fig.2 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the activities of defense enzymes in leaves of P.heterophylla

葉片防御酶活性的聚類分析表明（圖3），6個處理大致上分為2大類，即CK、T1、T5處理為一類，T2、T3、T4處理為一類。綜上說明促生菌KTS-1-1單獨噴施（T2處理）或與減量75.0%、87.5%的氮磷鉀復合肥配施（T3和T4處理）均有利于誘導提高葉片防御酶活性，而單施復合肥或高劑量復合肥與促生菌KTS-1-1配施（如T1和T5處理）對葉片防御酶活性大都具有抑制作用。

圖3 氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參葉片防御酶活性的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the activities of defense enzymes in leaves of P.heterophylla

2.2 氮磷鉀復合肥與促生菌 KTS-1-1配施對太子參生物量的影響

由表2可知，與CK處理相比，T2處理在株高、平均葉面積、塊根鮮重及塊根干重方面分別顯著提高了9.26%、18.78%、22.69%和17.66%，但在塊根鮮重、干重方面的促進效果則明顯不如推薦劑量氮磷鉀復合肥（T1處理）。與CK處理相比，復合肥與促生菌配施（T3、T4、T5處理）能在一定程度上起到促生作用，尤以T3和T4處理的促生效果最為明顯，T3處理在株高、平均葉面積、塊根鮮重及塊根干重方面分別顯著提高了13.22%、35.29%、46.25%和34.95%，T4處理分別顯著提高了10.20%、28.05%、70.62和54.95%，且T4處理相比T1處理塊根鮮、干重也分別顯著提高了7.84%和10.40%；盡管T5處理平均葉面積、塊根鮮重和塊根干重較T2處理有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，減量75.0%和87.5%的氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1配施（T3和T4處理）有助于提高塊根生物量，但高劑量復合肥配施（如T5處理）對生物量有抑制作用。

表2 氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參生物量的影響Table 2 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp.KTS-1-1 bacterial suspension on the biomass of P.heterophylla

2.3 氮磷鉀復合肥與促生菌 KTS-1-1配施對太子參品質的影響

2.3.1 對塊根多糖、皂苷及氨基酸含量的影響 由表3可知，相比CK處理，T1、T3和T4處理的塊根多糖和氨基酸含量均顯著提高，T1處理分別提高了24.58%和151.11%，T3處理分別提高了53.07%和62.22%，T4處理分別提高了35.38%和68.14%。T2處理在塊根多糖及皂苷含量方面與 CK處理無顯著差異（P＞0.05），但氨基酸含量顯著提高約31.10%。T5處理雖能一定程度地提高塊根多糖及氨基酸含量，但總體效果不及T3和T4處理。另外單施促生菌（T2處理）、氮磷鉀復合肥（T1處理）或復合肥與促生菌配施（T3、T4、T5處理）均對塊根皂苷含量無顯著影響。由此可見，復合肥推薦使用量（T1處理）和減量75.0%和87.5%的氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1配施處理（T3、T4處理）均有利于塊根多糖及氨基酸的形成。

表3 氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1施用對塊根多糖、皂苷及氨基酸含量的影響Table 3 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the contents of polysaccharides，saponins and amino acids in the roots of P. heterophylla

2.3.2 對塊根礦質元素含量的影響 由表4可知，所有處理的塊根鐵、錳、銅和鋅含量間均無顯著性差異（P＞0.05），但T1～T5處理鈣、鈷含量較CK處理均有顯著增加，鈣含量分別增加了 22.56%、32.22%、24.46%、29.17%和31.49%，鈷含量分別增加了15.94%、9.29%、19.84%、21.56%和26.61%。相比T2處理，T3、T4、T5處理鈷含量分別顯著提高了9.65%、11.23%和15.84%。相比CK處理，T2處理鎂含量顯著提高了9.32%，其余處理與CK處理相比鎂含量均無顯著差異（P＞0.05）。由此可見，促生菌KTS-1-1單獨噴施（T2處理）能明顯提高塊根鎂含量，所有促生菌和復合肥配施均有利于塊根對鈣、鈷元素的吸收。

表4 氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1施用對太子參塊根礦質元素含量的影響Table 4 Effects of the application of NPK compound fertilizer and Bacillus sp. KTS-1-1 bacterial suspension on the contents of mineral elements in the roots of P.heterophylla mg/kg

3 討論

PGPR是一類定殖于植物根際土壤的有益細菌。有研究[16-17]表明，接種PGPR能提高土壤中可吸收養分含量（如有效氮、有效磷），促進植株對這些養分吸收利用；亦可誘導增強植物自身免疫防御酶活性，增強植物對逆境的抵抗[7,18]；也能提高植物光合作用速率，促進碳氮代謝產物如氨基酸和多糖等物質合成[12,19]，以及通過氧化還原作用，分泌有機酸、螯合劑及提高植酸酶活性等機制促進植物對礦質元素的吸收累積[20-22]，從而促進植物生長，改善品質。本研究結果表明，促生菌處理（T2）不僅能提高太子參葉片氮、磷、鉀營養元素含量及葉片POD、PAL和 SOD活性，還能顯著提高太子參生物量（株高、平均葉面積及塊根鮮、干重）和促進塊根鈣、鎂和鈷元素積累，這與短短芽孢桿菌DZQ3誘導增強煙葉POD、PAL和SOD活性[7]，芽孢桿菌DZ31提高花生植株生物量（植株鮮、干重）及氮、磷、鉀營養元素含量[16]，以及紅根瘤菌（Rhizobium rubi）提高西蘭花（Brassica oleraceaL.）產量及改善氮、磷、鉀、鈣、鎂等礦質元素含量[23]的研究結果類似，這或許與其具有的促生效應（抗根腐病菌、溶無機磷及解鉀功能）有關。但在塊根品質方面，本研究結果顯示，促生菌處理（T2）對太子參塊根多糖、皂苷、氨基酸及鐵、錳、銅、鋅元素含量的影響作用不顯著，這與解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）提高黨參[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]塊根氨基酸含量[24]，根瘤菌（Rhizobiumsp.）改善蒙古黃芪（Astragalus mongholicusBunge.）塊根總多糖及總皂苷含量[25]，以及芽孢桿菌M3和芽孢桿菌OSU-142提高蘋果（Malus domesticaL.）葉片中鐵、錳、鋅等礦質元素含量[21]的研究結論不符。造成該差異的原因可能與研究使用的土壤性狀及PGPR的不同有關[26-27]。

另有研究[28-29]表明，在 PGPR的基礎上增施適量化學肥料有利于提高土壤中微生物種群密度及養分供應，進而促進植物生長及品質的改善。本研究中T4處理能明顯提高植株對土壤氮、磷和鉀的吸收，而T3、T5處理的作用效果較小，該結果與芽孢桿菌ZJM-P5配施不同水平氮、磷對紅小豆（Phaseolus angularisLinn）植株氮、磷含量影響的結論相似，即化肥配施不當（過高或過低）會抑制植株對氮、磷營養元素的吸收利用[30]。張朝輝[31]的研究結果表明，與常規施用復合肥相比，PGPR與適量的化肥（較常規減施20%復合肥）配施更有利于烤煙植株對土壤氮、磷和鉀的吸收，該研究結論與本文中T4比T1處理更有利于葉片氮、磷、鉀營養元素吸收積累的研究結果基本相似。在促生效應方面已有報道[19]，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）與低劑量氮磷鉀復合肥（復合肥推薦劑量的25%）配施表現出明顯的促生效應，與高劑量復合肥（復合肥推薦劑量的75%和100%）配施促生效應不顯著，這與本研究中T4處理太子參塊根生物量明顯高于T3和T5處理的結果相一致。

促生菌與化學肥料配施對植物防御酶活性和品質的影響也因肥料的劑量不同而有所不同。芽孢桿菌ZJM-P5與不同水平氮、磷配施對紅小豆的生長試驗[30]表明，在相同促生菌濃度下根系SOD和POD活性隨氮和磷水平增加，表現為先升高后降低的趨勢。固氮螺菌（Azospirillum）和固氮菌（Azotobacter）復合菌劑與不同劑量化肥配施對向日葵（Helianthus annuusL.）產量及品質試驗[32]表明，與配施全量化肥相比，25%～50%的全量化肥配施能明顯提高果實產量、蛋白質及油脂含量。Nascente等[33]研究發現，相比120kg/hm2氮肥供應水平，沙雷氏菌（Serratiaspp.）BRM 32114在40和 80kg/hm2氮肥供肥水平下更有利于水稻谷粒產量的增加，并增加谷粒中氮、鈣、鎂等礦質元素含量。在本研究結果中，與促生菌―高劑量復合肥配施（T5處理）相比，低、中劑量復合肥配施（T3和T4處理）更利于誘導提高葉片SOD、PAL和POD的活性，改善塊根品質（多糖、氨基酸、鈣、鈷含量），這與上述研究報道對紅小豆[30]、向日葵[32]及水稻[33]的研究結論類似。

此外，Chen等[34]研究結果表明，氮肥合理供應條件下能顯著提高小麥PAL和POD的活性，促進木質素等酚類產物合成，這與本研究中T1處理抑制PAL和POD活性的結果相反，可能與作物類型和土壤養分供應差異相關。而Shin等[35]和Ková?ik等[36]的研究報道顯示，氮和磷養分缺乏能誘導激發植株防御酶基因（AtNrt2.1、AtPT2）表達上調，提高酚類產物代謝相關酶（如POD、PAL）活性。

4 結論

相比常規氮磷鉀復合肥處理（T1）、單施促生菌KTS-1-1處理（T2）及減量50.0%和87.5%的常規氮磷鉀復合肥與促生菌 KTS-1-1配施處理（T3和T5），減量75.0%的常規氮磷鉀復合肥與促生菌KTS-1-1配施（T4）更有利于太子參生長，提高葉片中氮、磷、鉀營養元素含量及SOD、PAL和POD的活性，且該處理在改善塊根品質方面（氨基酸除外）也能達到常規氮磷鉀復合肥處理（T1）的施用效果，進而說明了該處理方案在太子參無公害栽培中有潛在的應用價值。