葉面噴施炭吸附聚谷氨酸對玉米生長發育的影響

曹麗茹 魯曉民 王國瑞 黨 尊 邱 天邱建軍 田云峰 王振華 黨永富

（1河南遠東生物工程有限公司，466000，河南周口；2河南省農業科學院糧食作物研究所，450002，河南鄭州；3河南省農業科學院科研管理處，450002，河南鄭州）

玉米是重要的糧飼兼用作物和工業原料。21世紀初，全球玉米產量超過水稻和小麥，位居三大糧食作物之首[1]，每年種植面積達4000萬hm2[2]。在玉米生長發育的過程中，常因極端氣候[3-4]、病蟲害[5]和種植密度[6]等環境因素，影響玉米的品質和產量。隨著深加工技術的發展和再生能源的興起，作為能源原料的玉米需求量日益增加，故在惡劣環境及現有技術條件下，保障穩產高產是玉米生產的重中之重[7]。

通過現代生物學技術改善作物品質、提高產量已經在農業、林業、園藝等領域廣泛應用[8-9]。研究[10]發現，葉面噴鋅可以提高玉米過氧化氫酶活性，增加產量；葉面噴施光碳核肥可以提高水稻的品質與產量[11]；玉米噴施多效唑，通過提高葉片光合作用的強度來提高產量[12]；玉米噴施油菜素內酯，增強了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）的活性，從而提高了葉片的光合作用強度[13]；矮壯素通過增強葉片的抗氧化酶活性來提高玉米的抗衰老功效[14]。通過葉面噴施水溶肥，植物能快速吸收所需要的養分，增強抗逆性，提高產量。聚谷氨酸在農業上的應用研究得到廣泛的關注及探索，其常用作保水劑、肥料增效劑和肥料來使用[15]。研究[16-18]發現，聚谷氨酸可以提高經濟作物對礦物質元素的吸收，增強植物的抗性和光合作用，同時可提高作物產量。炭吸附聚谷氨酸是在聚谷氨酸基礎上經過生物炭處理而得到的新型材料，具有良好的水溶性、吸水性和緩解性，對環境安全友好。研究[19]表明，連續使用炭吸附聚谷氨酸水溶肥可提高土壤有機質含量；白菜噴施炭吸附聚谷氨酸水溶肥提高了土壤速效磷和速效鉀的含量[20]；玉米 6～9葉期噴施炭吸附聚谷氨酸水溶肥可顯著提高玉米的穗粒數和千粒重[21]。但關于炭吸附聚谷氨酸水溶肥對玉米生理生化方面的影響尚未見報道。

本文以鄭單958和鄭單1868為材料，在拔節期噴施炭吸附聚谷氨酸水溶肥（下面簡稱炭吸附聚谷氨酸），15d后測定葉片的葉綠素含量、凈光合速率（Pn）、二磷酸核酮糖加氧酶（Rubisco）活性、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、氣孔密度、氣孔張開程度、抗氧化酶活性、滲透調節物質含量及關鍵酶基因的相對表達量，同時分析玉米植株的養分吸收能力、籽粒鮮重和產量，分析炭吸附聚谷氨酸對玉米生理生化及產量的影響，為玉米高產栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米（Zea maysL.）品種鄭單 958（ZD958）和鄭單 1868（ZD1868）均由河南省農業科學院糧食作物研究所玉米遺傳育種室提供。供試炭吸附聚谷氨酸水溶肥由河南遠東生物工程有限公司生產和提供，其主要成分包括有機質（≥80.0g/L）、聚谷氨酸（≥10.0g/L）和水不溶物（≤10.0g/L）。

1.2 試驗方法

于2020年在河南省現代農業研究開發基地進行試驗，供試地塊地勢平坦，土壤肥力中等。耕作層（0～20cm）土壤含氮100.95mg/kg、有效磷28.1mg/kg、速效鉀143mg/kg、有機質30.1g/kg，pH 7.25。采用小區隨機排列種植，玉米拔節期（第9葉完全展開）噴施炭吸附聚谷氨酸（炭吸附聚谷氨酸3.75kg/hm2+水 450kg/hm2，T），同時噴施清水作為對照處理（CK），從播種到收獲期間的管理與田間正常管理一致。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 葉綠素含量 噴施炭吸附聚谷氨酸15d后，取穗部完全展開的葉片0.50g，加入80%丙酮10mL進行研磨，離心后取上清液1mL分別在663、645和470nm的波長下測其OD值，用80%丙酮作對照，計算葉綠素含量[22]。

1.3.2 光合相關參數及氣孔情況 在上午 9:00-12:00使用LI-6400便攜式光合儀測定穗部完全展開葉的Pn、Gs和Tr。葉片的水分利用率（WUE）=Pn/Tr，重復3次，取平均值。

取測定光合作用的葉片1～3mm2（不含葉脈），用磷酸鹽緩沖生理鹽水輕輕漂洗后，放入戊二醛電鏡固定液中室溫固定 2h；使用磷酸緩沖液（0.1mol/L、pH 7.4）漂洗3次，每次15min；葉片依次放入 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的酒精中，每次15min，再放入乙酸異戊酯中15min；將樣本緊貼于導電碳膜雙面膠上，放入離子濺射儀樣品臺進行噴金約 30s；在掃描電子顯微鏡（HITACHI-SU8100）下觀察不同視野中氣孔的數目和張開程度，并拍照。

1.3.3 酶活性和脯氨酸含量 采用植物酶聯免疫分析試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司生產）測定Rubisco活性。采用抗壞血酸氧化脫氫顯色原理進行比色測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；在鄒琦[23]方法的基礎上，利用光化學還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[24]；采用磺基水楊酸提取―茚三酮顯色法測定游離脯氨酸（Pro）含量[25]。

1.3.4 實時熒光定量PCR 使用Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA。以CK和T處理下鄭單958和鄭單1868的cDNA作為基因擴增的模板，選取與抗氧化物酶活性和Pro合成相關的基因設計引物（表1），以玉米18S基因作為內參，使用TaKaRa的TB GreenTM Premix EX TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，進行實時熒光定量PCR反應。采用2–??Ct法計算基因相對表達量。

表1 引物名稱與序列Table 1 Names and sequences of primers

1.3.5 玉米植株營養元素吸收和產量相關指標用H2SO4-H2O2消煮，采用奈氏比色法測定N元素含量，采用鉬銻抗比色法測定P元素含量，采用火焰光度計法測定K元素含量[26]。

授粉后第17天開始取樣，之后每隔9d取1次樣，整個生長過程共取4次樣（分別在授粉后17、26、35和44d）。取樣時每小區選取有代表性植株6株，去皮稱果穗，記為穗鮮重，剝取玉米穗中部正常籽粒100粒，迅速稱重，記為百粒鮮重。成熟期玉米地上部分放入烘箱，在105℃殺青30min后，于80℃烘干至恒重后稱干重。

玉米成熟期考種測產，各小區隨機選取 50穗玉米，記錄穗行數和行粒數，并計算籽粒鮮產量，產量（kg/hm2）=（每公頃穗數×穗行數×行粒數×單粒粒重）/1000。

1.4 數據處理

數據均取3次重復的平均值，采用SPSS 22軟件進行方差分析和關聯分析，各項生理生化指標和基因表達水平進行差異顯著性檢驗，用Duncan’s新復極差法進行多重比較（P＜0.05），利用Microsoft Excel做柱形圖。

2 結果與分析

2.1 噴施炭吸附聚谷氨酸對玉米長勢及干重的影響

由圖1可知，拔節期噴施炭吸附聚谷氨酸后的2個品種長勢均較為旺盛，葉片全展開，葉面積較大，利于光合作用，莖稈較粗，可提高抗倒伏性。圖2顯示，與CK處理相比，T處理促進了玉米單株干重的增加，其中ZD958的單株干重增加了25.80%，ZD1868增加了26.25%，均達到了極顯著差異水平。結果說明炭吸附聚谷氨酸顯著提高了玉米的生物量，促進了玉米的生長發育。同時發現，ZD1868的干物質含量在噴施炭吸附聚谷氨酸前后均比ZD958的干物質含量多，推測可能是 ZD1868和ZD958品種間存在遺傳差異的原因。

圖1 炭吸附聚谷氨酸對玉米生長發育的影響Fig.1 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on the growth and development of maize

圖2 炭吸附聚谷氨酸對玉米干重的影響Fig.2 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on dry weight of maize

2.2 炭吸附聚谷氨酸對玉米葉片葉綠素含量的影響

由圖3可知，噴施炭吸附聚谷氨酸后，極顯著提高了2個品種的葉綠素含量。與CK處理相比，ZD958葉綠素含量提高了 17.74%，ZD1868提高了 23.67%。CK處理 ZD1868的葉綠素含量高于ZD958，說明CK處理下ZD1868的光合能力亦強于ZD958。

圖3 炭吸附聚谷氨酸對玉米葉片葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on chlorophyll contents of maize leaves

2.3 炭吸附聚谷氨酸對玉米光合作用的影響

圖4顯示，噴施后2個品種的Pn均極顯著提高，其中 ZD958提高了 23.88%，ZD1868提高了25.25%，說明炭吸附聚谷氨酸對ZD1868的光合作用強度影響較大。圖4顯示，噴施炭吸附聚谷氨酸后葉片的Gs和Tr均有所增大，但未達到顯著差異水平，ZD1868和ZD958的水分利用率則顯著提高。噴施炭吸附聚谷氨酸后，ZD958和 ZD1868的Rubisco活性分別提高了3.20%和3.04%（圖4）。同時發現，2個處理下，ZD1868的Pn、Gs及Tr均大于ZD958。

圖4 炭吸附聚谷氨酸對玉米葉片光合作用的影響Fig.4 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on photosynthesis of maize leaves

以上結果表明，炭吸附聚谷氨酸促進Gs的增大，使玉米葉片能更好地吸收炭吸附聚谷氨酸的成分，從而提高了Rubisco的活性，最終增強光合作用。

2.4 炭吸附聚谷氨酸對葉片氣孔密度和張開程度的影響

與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的氣孔密度無顯著變化，氣孔的長度和密度也沒有明顯的差異（圖5，表2），表明炭吸附聚谷氨酸不影響玉米氣孔的發育。與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的氣孔張開程度變化較大，其中ZD958葉片中完全張開和半張開氣孔數目分別增加了80.50%和16.28%。ZD1868葉片中完全張開和半張開氣孔數目分別增加了38.70%和26.67%。2個品種的完全閉合氣孔數目較少，在50.00%以下（圖6）。該結果與上述噴施炭吸附聚谷氨酸后光合作用強度顯著提高的結果一致。同時發現，噴施炭吸附聚谷氨酸前后，ZD1868的氣孔張開程度均高于ZD958氣孔的開放程度。

圖5 炭吸附聚谷氨酸對玉米葉片氣孔形態的影響Fig.5 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on stomata shape of maize leaves

表2 炭吸附聚谷氨酸對玉米葉片氣孔密度和大小的影響Table 2 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on stomata density and size of maize leaves

圖6 炭吸附聚谷氨酸對玉米葉片氣孔張開程度的影響Fig.6 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on stomata opening degree of maize leaf

2.5 炭吸附聚谷氨酸對抗氧化物酶活性及相關基因表達的影響

由圖7a～c可知，與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的SOD、POD和APX活性均極顯著提高。其中，ZD958和ZD1868的SOD活性分別提高了 9.37%和 12.30%，POD活性分別提高了15.54%和17.87%，APX活性分別提高了84.14%和109.80%。結果說明炭吸附聚谷氨酸提高了玉米葉片的抗氧化酶活性，尤其對APX活性影響較大。

圖7 炭吸附聚谷氨酸對玉米葉片抗氧化物酶活性及相關基因表達的影響Fig.7 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on antioxidant enzyme activities and related genes expression of maize leaf

通過實時熒光定量 PCR進一步對關鍵基因表達量進行分析，結果如圖7d～f所示，與CK處理相比，噴施炭吸附聚谷氨酸后，合成這3種酶的基因ZmSOD、ZmPOD和ZmAPX在ZD958和ZD1868中的表達量極顯著升高。抗氧化酶活性增強和相關基因表達量升高表明炭吸附聚谷氨酸啟動了玉米體內清除活性氧有害自由基的系統。

2.6 炭吸附聚谷氨酸對滲透調節物質Pro相關基因表達的影響

由圖8a可知，與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的Pro含量分別提高了50.16%和49.42%，均達到極顯著水平。對合成脯氨酸關鍵酶基因ZmP5CR的表達量進行分析，如圖8b所示，與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868中ZmP5CR的表達量分別提高了41.80%和80.00%，表明炭吸附聚谷氨酸促進了玉米葉片Pro的合成。

圖8 炭吸附聚谷氨酸對Pro含量及相關基因表達的影響Fig.8 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on Pro content and related gene expression of maize leaves

2.7 炭吸附聚谷氨酸對玉米植株營養元素的影響

由表3可知，與CK處理相比，T處理顯著或極顯著地提高了ZD958和ZD1868的N、P和K元素含量，其中ZD958的N、P和K含量分別提高了25.14%、27.57%和19.42%，ZD1868分別提高了26.87%、26.82%和16.22%，且ZD1868的營養元素含量要高于同條件下ZD958的營養元素含量。

表3 炭吸附聚谷氨酸對玉米植株營養元素的影響Table 3 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on mineral elements in maize plants mg/kg

2.8 炭吸附聚谷氨酸對玉米百粒鮮重及產量的影響

由圖9a可知，隨著授粉時間的增加，ZD958和ZD1868的百粒鮮重逐漸增加，授粉47d時達到最大值。在授粉15、25、33和47d時，T處理下ZD958的百粒鮮重分別比CK處理的增加了6.40%、9.20%、11.38%和 6.87%，ZD1868分別比 CK處理增加了8.80%、10.20%、7.22%和7.10%。2個處理下對應的每個階段ZD1868的百粒鮮重均比ZD958的高。結果表明，炭吸附聚谷氨酸可提高玉米百粒鮮重，并且ZD1868的百粒鮮重比ZD958高。

圖9 炭吸附聚谷氨酸對玉米百粒鮮重及產量的影響Fig.9 Effects of carbon-adsorbed of polyglutamic acid on 100-seed fresh weight and yield of maize

由圖9b可知，與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的產量極顯著提高，ZD958和ZD1868分別提高了11.01%和12.00%。同一個處理下ZD1868產量均比ZD958產量高。結果表明，炭吸附聚谷氨酸可提高玉米產量，并且ZD1868的產量比ZD958高。

2.9 玉米光合性能、滲透調節、養分吸收等指標與產量的灰色關聯分析

玉米光合性能、滲透調節和養分吸收等指標與產量的量綱化不一致，首先對所有原始數據進行無量綱化處理，設產量為母序列，設其他指標X1～X15為子序列，對各指標數值進行標準化。對標準化后的數據進行關聯度分析。由表4可知，光合作用和百粒重與產量的相關度高達0.95和0.94。其他指標與產量的關聯度也較高（≥0.3297），依次是WUE、Rubisco活性、完全張開氣孔數目、完全閉合氣孔數目、Gs、葉綠素含量、Tr、半張開氣孔數目、SOD活性、Pro含量、POD活性、氣孔密度和APX活性。結果表明，光合作用相關參數與產量密切相關，膜系統相關參數與產量間接相關。

表4 光合作用和膜系統相關性狀與產量的關聯度及關聯序Table 4 Correlation degree and correlation order between photosynthesis and membrane system related traits and yield

3 討論

目前，現代生物學技術在玉米生產上主要通過調控光合強度、抗氧化活性、增加穗粒數等性狀來提高玉米的品質和產量[27]。炭吸附聚谷氨酸是一種含有高分子有機質的生物材料。葉片噴施炭吸附聚谷氨酸后，所含有的高分子生物材料通過表面吸附作用傳輸于玉米葉片，然后運輸到玉米的其他器官。

光合作用是植物在可見光的照射下，利用光合色素，將光能轉換為化學能，是植物賴以生存的基礎。其中葉綠素是最重要的光合色素之一，Rubisco是光合作用中固定CO2的關鍵酶之一。有試驗[28]表明，外源NO能提高Rubisco活性，增強CO2的同化效率和光合電子傳遞效率，增加 RuBP固定CO2的能力。本研究表明，與CK處理相比，T處理下 ZD958和 ZD1868的葉綠素含量分別極顯著提高了17.74%和23.67%（圖3）；同時極顯著提高了ZD1868和ZD958的Rubisco活性（圖4e）；與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的Pn分別極顯著提高了23.88%和25.25%，Gs和Tr均有所增大，但ZD1868和ZD958的水分利用率仍然極顯著提高。結果說明炭吸附聚谷氨酸通過促進氣孔張開，一方面使玉米葉片能更好地吸收炭吸附聚谷氨酸含有的高分子有機物質，另一方面增加氣體交換，提高Rubisco活性，從而增強玉米葉片的光合作用和水分利用率。外源噴施化控試劑“五谷豐”增強玉米的葉綠素含量，提高葉片的Pn，增強了葉片的光合能力，延緩了葉片衰老[29]。外源噴施化控試劑“玉黃金”同樣提高了玉米的葉綠素含量、Pn、最大光化學效率Fv/Fm和實際量子產量Y（Ⅱ）[30]。本文所用的炭吸附聚谷氨酸水溶肥提高了葉綠素含量和Pn，促進了玉米葉片的光合能力，與“五谷豐”和“玉黃金”具有類似的作用。張浩等[31]證實，氣孔張開可增加內外氣體的交換，利于植株光合作用。本研究利用掃描電鏡觀察葉片氣孔，與CK處理相比，T處理不影響ZD958和ZD1868氣孔密度，但增加了完全張開和半張開氣孔數目，而完全閉合氣孔數目極顯著降低。該結果與上述噴施炭吸附聚谷氨酸后光合作用強度極顯著提高的結果一致。

SOD、POD和APX是植物組織清除O2、-OH和 H2O2來減少活性氧的關鍵酶，可減輕對葉綠體細胞膜的傷害，保護細胞膜系統[32]。本研究結果表明，與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的SOD活性分別提高了9.37%和12.3%，POD活性分別提高了15.54%和17.87%，APX活性分別提高了84.14%和109.8%；合成這3種酶的基因ZmSOD、ZmPOD和ZmAPX在ZD958和ZD1868中的表達量極顯著升高。生理指標和響應基因表達模式的分析證實炭吸附聚谷氨酸提高了玉米葉片的抗氧化酶活性，啟動了玉米體內活性氧清除系統，保護細胞膜，尤其是對APX活性影響較大。Pro是重要的滲透調節物之一，它的積累可降低細胞的滲透勢，使細胞吸收更多的水分以維持細胞正常的膨壓，從而保護細胞膜[33]。?1-二氫吡咯-5-羧酸還原酶（P5CR）是催化?1-二氫吡咯-5-羧酸（P5C）合成Pro的關鍵酶之一，前人研究[34]證實，編碼P5CR的轉基因株系中Pro含量提高，且耐旱和抗鹽等非生物脅迫能力顯著提高。本研究表明，與CK處理相比，T處理下ZD958和ZD1868的Pro含量分別極顯著提高了50.16%和49.42%，同時ZmP5CR基因在ZD958和ZD1868中表達量均顯著升高。炭吸附聚谷氨酸通過提高玉米抗氧化酶活性和促進Pro的積累來保護細胞膜和提高細胞吸水及保水能力。

本研究結果表明，與CK處理相比，T處理顯著提高了ZD958和ZD1868的N、P和K營養元素的含量和產量，明顯提高了百粒鮮重。說明噴施炭吸附聚谷氨酸可提高玉米植株營養元素的運輸與儲存能力，改善玉米器官的光合能力，使得葉片產生較多的光合產物運輸到庫器官，提高了玉米籽粒鮮重。玉米產量的高低與籽粒重密切相關，增加籽粒重是提高產量的關鍵因素。

綜上所述，炭吸附聚谷氨酸可能通過提高玉米葉片的葉綠素含量，并促進葉片氣孔的張開程度，從而提高光合性能，增加對太陽能的固定，同時提高對N、P和K營養元素的吸收能力，調控玉米體內同化物質的運輸和分配，促進玉米干物質的增加，提高產量。同時提高滲透調節物質和抗氧化酶相關基因的表達，積累滲透調節物質、提高抗氧化酶活性，更好地保障玉米的生長發育，該結果與前人研究[35]較為一致。ZD1868的生理指標、營養元素及生長狀況在同等條件下均優于 ZD958，而且ZD1868的百粒鮮重和產量均明顯大于ZD958，推測造成該現象的主要原因之一是品種間存在遺傳差異。

影響產量及相關性狀的因素很多，目前的報道主要集中在穗部性狀。魏湜等[36]研究表明，穗長是影響玉米產量的最關鍵因素，百粒重次之，隨后是行粒數和穗粗。郭金生等[37]研究表明，灰色關聯分析可有效評價影響因子與主效因子之間的相關性。本研究利用灰色關聯分析法，探究玉米葉片生理生化指標與產量的相關性，發現光合作用和百粒重與產量的相關度高達0.953和0.943，然后依次是水分利用率、Rubisco、完全張開氣孔、完全閉合氣孔數目、Gs、葉綠素含量、Tr、半張開氣孔數目、SOD活性、Pro含量、POD活性、氣孔密度和APX活性。該研究結果為培育玉米高產新品種提供理論參考。

4 結論

葉面噴施炭吸附聚谷氨酸水溶肥，顯著增強了鄭單958和鄭單1868的光合作用強度和水分利用率，提高了抗氧化酶POD、SOD、APX的活性、Pro含量及關鍵酶基因（ZmSOD、ZmPOD、ZmAPX和ZmP5CR）的相對表達量，提高了鄭單958和鄭單1868的氮、磷和鉀含量和產量。該結果為生產上使用炭吸附聚谷氨酸提高玉米產量提供了理論依據，也為進一步深入研究炭吸附聚谷氨酸影響籽粒鮮重和產量的內在機理奠定了基礎。由于調節劑存在專一性和時效性，要系統了解炭吸附聚谷氨酸對玉米生長發育的影響機制，今后將開展多年多點的試驗鑒定，為炭吸附聚谷氨酸在玉米生產上的應用提供科學依據。