小麥品種周麥22抗葉銹病的QTL定位

閆曉翠 段振盈 楊華麗 姚占軍 李在峰

（1河北農業(yè)大學植物保護學院/河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心，071001，河北保定；2河北農業(yè)大學農學院/華北作物種質資源研究與利用教育部重點實驗室，071001，河北保定）

小麥葉銹病是由葉銹病菌（Puccinia tirticina）侵染引起的真菌病害，致病菌屬于活體寄生菌，主要侵染小麥葉片，但在發(fā)病嚴重或高度感病的小麥品種中，也可侵染葉鞘和穎殼[1-2]，該病害是影響世界小麥生產安全的主要病害之一。幾乎每年小麥主產區(qū)均有葉銹病的發(fā)生，20世紀中后期墨西哥西北部發(fā)生葉銹病害大流行，產量損失高達70%[3]，在中國華北冬麥區(qū)發(fā)生過6次（1969、1973、1975、1979、2012和2015年）葉銹病害流行，其中僅2015年產量損失就高達19.1萬t[4-5]。近年來，小麥葉銹病發(fā)生危害有明顯加重趨勢。雖然采用化學藥劑能短暫防治葉銹病，但培育廣譜抗病品種是行之有效的最佳方法。

小麥對葉銹病抗性分為小種專化抗性（race specific resistance）和非小種專化抗性（non-race specific resistance）[6]。小種專化抗性通常是對特定菌種表現出抗性，常發(fā)生在小麥苗期，又稱為苗期抗性，常因病原菌毒性的變異而喪失[7-8]，通過基因聚合和基因布局可以延長此類抗性基因的有效性。非小種專化抗性一般對1種病原菌的多個不同生理小種或者多種病原菌有效，一般在成株期表現，通常具有慢銹抗病性（slow rusting resistance）和持久抗病性（durable resistance）的特點[9]，多個抗性基因的聚合可能表現出對此類病菌完全抗病。

至今，已正式命名的抗葉銹病基因（Lr）有79個[10]，其中大部分為苗期抗病基因，僅有16個抗葉銹病基因表現為成株抗性（Lr12、Lr13、Lr22a、Lr22b、Lr34、Lr35、Lr37、Lr46、Lr48、Lr49、Lr67、Lr68、Lr74、Lr75、Lr77和Lr78）。其中，Lr34/Yr18/Pm38/Sr57[11]、Lr46/Yr29/Pm38/Sr58[12]和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55[13]等基因兼抗多種病害，具有一因多效及抗性持久穩(wěn)定的優(yōu)點。SSR標記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強、共顯性高及成本低等優(yōu)點，常被廣泛應用于抗病基因的初步定位[14]。2016年，師令智等[15]利用SSR標記在CIMMYT品系19HRWSN-76中定位出1個苗期葉銹抗病基因LrHR76；2015年，王佳真等[16]在濰麥8號中定位到1個位于2AS染色體上的成株QTL位點QLr.hbau-2AS。

小麥品種周麥22（國審麥2007007）是河南省周口市農業(yè)科學院選育出的優(yōu)良品種，該品種為半冬性品種，具有產量高、品質優(yōu)、農藝性狀優(yōu)良及抗病性好等優(yōu)點，在我國黃淮冬麥區(qū)南部得到了大面積推廣和應用。至2019年周麥22累計種植面積達670萬hm2，高產穩(wěn)產的原因之一是對小麥葉銹病[17]和條銹病[18]均表現出良好的抗性。Wang等[17]對周麥22進行了苗期抗葉銹病研究，定位到1個苗期抗葉銹病基因LrZH22。為了明確其所攜帶的成株抗葉銹基因，本研究利用周麥22/銘賢169及其255個F2:3家系，對其進行成株期抗葉銹病QTL分析，并結合已有的研究結果進行比較，挖掘周麥22中抗小麥葉銹病的新QTL位點，并找到與QTL緊密連鎖的分子標記以應用于輔助選擇育種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗病親本為周麥22，系譜：周麥12（周8425A/SW73295）/溫 6//周麥 13（周 8425B/周麥 9 號），感病親本銘賢 169及其雜交、自交獲得的 255個F2:3家系群體；感病對照品種為鄭州5389，也作為葉銹菌的擴繁材料。于小麥成株期接種3個葉銹菌生理小種FHRT、THTT和THJT的混合菌種。小種的命名采用Long等[19]的四字母命名法。所有供試材料和葉銹菌種均由河北農業(yè)大學植物保護學院小麥銹病實驗室提供。

1.2 成株期接種和侵染型調查

于2014-2015和2015-2016年度將抗病親本周麥22、感病親本銘賢169及其255個F2:3代群體分別播種于河北農業(yè)大學（河北保定）試驗地。田間種植方式為行距25cm，行長1.5m，每行25粒，每9行加種1份感病品種鄭州5389作為發(fā)病對照。適當澆水、施肥和田間除草。

在小麥拔節(jié)期采用噴霧法進行田間接種，接種日期通常為4月下旬的16:00，確保土壤有一定濕度。若土壤太旱，需在接菌前2d進行灌溉，避免接菌時濕度不夠而影響接種質量。當感病對照鄭州5389病斑占葉片的表面積達100%時進行田間成株表型鑒定，即最終病害嚴重度（final disease severity，FDS）。其接菌流程與田間病害表型鑒定參考Li等[20]的方法。

1.3 DNA提取及分子標記篩選

利用CTAB法[21]提取抗病親本周麥22、感病親本銘賢169及其F2:3代家系小麥葉片全基因組DNA，其中每份材料分別選取3～5株進行DNA混合提取，并分別用 1×TE稀釋成 40～50ng/μL工作液，作為大群體的篩選。此外，參照Hao等[22]提出的優(yōu)選小群體（PSG）策略構建抗感小群體，結合田間FDS從中選取5個抗病（FDS 5%以下）和5個感病（FDS盡量選最大，接近 100%）的家系植株，分別提取葉片全基因組DNA作為抗感小群體。利用分布在所有小麥染色體組的1005對SSR標記對周麥22、銘賢169及抗感小群體進行多態(tài)性分子標記篩選。所需的PCR擴增體系、反應程序和PCR檢測參考王佳真等[23]的方法。

1.4 遺傳圖譜構建及QTL定位

以多態(tài)性SSR分子標記篩選抗感親本及其255個F2:3家系，將田間成株葉銹病FDS與篩選的基因型數據進行整理。利用 Excel軟件分析田間成株期葉銹病表型的分布，采用QTL Cartographer軟件進行遺傳定位分析，其LOD值設為2.5，分析有效的QTL位點貢獻率和加性效應等遺傳信息。

2 結果與分析

2.1 周麥 22/銘賢 169 F2:3群體成株期葉銹病抗性表型分

依據 FDS分析可知，感葉銹病對照品種鄭州5389在2個年度的FDS分別為90%和100%，表明在每個環(huán)境中抗病親本周麥 22/感病親本銘賢 169 F2:3群體的葉銹病發(fā)病良好。其抗病親本周麥22的FDS在5%左右，感病親本銘賢169的FDS在80%以上，255個家系的葉片病斑面積呈1%～100%的連續(xù)性分布，說明該群體呈現數量性狀遺傳特性（圖1）。

圖1 周麥22/銘賢169 F2:3葉銹病最終嚴重度的頻率分布Fig.1 Frequency distributions of the FDS of Zhoumai 22×Mingxian 169 F2:3 lines for leaf rust

此外，由表1可知，在2個年度中抗病親本周麥22和感病親本銘賢169的平均FDS分別為5%和85%，且在其群體中的平均FDS為30.5%～30.9%。同時，對2個年度中葉銹病FDS的相關系數進行計算，其呈現出顯著相關（P＜0.001），葉銹病FDS的相關系數（r）為0.95。

表1 周麥22/銘賢169 F2:3 255個群體在2個年度中的FDSTable 1 FDS for leaf rust of 255 F2:3 from Zhoumai 22×Mingxian 169 in two years

2.2 葉銹病成株期抗性QTL分析

利用分布于小麥染色體上的現存 1005對 SSR引物進行親本多態(tài)性篩選，獲得304對多態(tài)性SSR引物。將這些多態(tài)性標記應用于抗感小群體的篩選，獲得交換值低于30%的55對多態(tài)性SSR標記（表2），并用其對周麥22/銘賢169的255個F2:3家系進行多態(tài)性篩選獲得基因型。再結合2個年度的FDS結果，在群體中檢測到2個成株抗性QTL，暫將其命名為QLr.hbau-1BL和QLr.hbau-2BS（表3和圖2）。2個成株抗性QTL均來自抗性親本周麥22，且這2個QTL均在2個年度中穩(wěn)定被檢測到（圖2）。

表2 55對SSR標記信息Table 2 Information of 55 SSR markers

續(xù)表2 Table 2 (continued)

表3 周麥22/銘賢169 255個F2:3家系的葉銹病FDS的QTLTable 3 QTL for FDS to leaf rust in 255 F2:3 lines from Zhoumai 22/Mingxian 169

圖2 位于1BL和2BS染色體上連續(xù)2年成株抗葉銹病Fig.2 Leaf rust adult-plant resistance QTL on chromosomes 1BL and 2BS in two years

由表3可知，第1個QTLQLr.hbau-1BL的側翼標記為Xwmc31和Xwmc631，分別解釋了2014-2015和 2015-2016年度表型變異為 9.62%和11.88%，加性效應分別為10.17%和14.56%。第2個QTLQLr.hbau-2BS側翼標記Xgwm374和Xbarc55位于2BS染色體上，在2014-2015和2015-2016年度中均能檢測到，分別解釋了20.99%和16.89%的表型變異，其加性效應分別為14.09%和16.50%。結果表明，抗病品種周麥22中至少存在2個穩(wěn)定有效的QTL，且表現出較高的抗性。因此，鑒定的QTL可作為抗葉銹病品種的親本。同時，這些位點和它們緊密連鎖的分子標記對于基因精細定位和分子標記輔助選擇有重要作用。

3 討論

本研究共檢測到2個抗葉銹病QTL分別是QLr.hbau-1BL和QLr.hbau-2BS。QTL解釋的總表型變異在葉銹病環(huán)境中為 9.62%～20.99%，證明它們對減輕病害嚴重程度的顯著作用。目前，位于1B染色體上的基因或QTL有Lr46/Yr29[24]、QLr.caas-1BL[25]、QLr.pser-1BL[26]、QLr.hbu-1BL.2[27]及本研究中的QLr.hbau-1BL，根據它們的連鎖或側翼標記csLv46g22、Xwmc59-Xbarc213、Xwmc631-Xgwm268、Xbarc80-Xwmc728和Xwmc31-Xwmc631，確定其物理位置依次為670.2、667.2、637.2、685.1-686.7和610.35Mb。可知本研究中的QLr.hbau-1BL位點可能為新的成株抗葉銹位點。但由于標記區(qū)間較寬，還需要對圖譜進行加密和進一步檢驗。對本研究中的第2個位于2B染色體上的抗病QTLQLr.hbau-2BS進行分析，有5個已知的抗葉銹病基因定位于小麥 2BS染色體上，分別為Lr13[28]、Lr16[29]、Lr23[30]、Lr73[31]和LrZH22[17]。Wang 等[17]在周麥 22中定位了苗期抗葉銹病基因LrZH22，與本研究中QLr.hbau-2BS位置一致，均位于緊密連鎖的SSR標記Xbarc55和Xgwm374之間，抗性由已知抗葉銹病基因LrZH22提供，其抗病QTL均來自同一親本周麥22。

周 8425B作為河南省骨干親本廣泛應用于我國小麥育種中。Zhang等[32]研究表明，LrZH22來源于周8425B的姊妹系周8425A，且具有全生育期抗性。Zhang等[33]對部分周麥系列品種進行了抗性鑒定和標記分析，發(fā)現攜帶抗病基因LrZH22的品種在田間均表現很好的抗葉銹性，目前已知攜帶LrZH22的周麥系列品種有周8425B、周麥11、周麥18、周麥22、周麥28和周麥30等。因此目前我國有效抗葉銹病基因為抗葉銹病基因LrZH22，抗性穩(wěn)定，在不同抗性群體中的貢獻率均很顯著，有利于小麥抗葉銹病基因育種的研究。小麥品種中國春完整基因組序列公示將會極大促進小麥抗葉銹病基因的定位和克隆。同時根據中國春參考序列，可開發(fā)出緊密連鎖或共分離分子標記，從而對定位的抗病基因進行精細定位，并用于分子標記輔助選擇育種。

本研究中在周麥22中定位了2個抗葉銹病位點，可能還含有其他抗病位點，有待下一步研究。同時，本研究中找到的與抗病基因緊密連鎖的分子標記可用于對抗病基因品種的篩選。

4 結論

在周麥22/銘賢169的255個F2:3家系群體中定位出2個抗病QTL，為QLr.hebau-1BL和QLr.hebau-2BS，分別解釋9.62%～11.88%和16.89%～20.99%的表型變異。其中QLr.hebau-1BL可能為1個新的成株抗病位點，而QLr.hebau-2BS可能為全生育期抗病基因LrZH22。這2個抗病位點在2個年度中均表現出良好的抗性，為今后進一步基因挖掘及分子標記輔助選擇育種提供良好基礎。