谷子miR169家族及其靶基因的鑒定與功能分析

盧 平 康慶芳 趙孟瑤 張鳳潔 武強強馬芳芳 王宇珅 韓淵懷 王興春 李雪垠

（1山西農業大學生命科學學院，030801，山西晉中；2山西農業大學農學院，030801，山西晉中）

谷子（Setaria italica）屬單子葉禾本科二倍體植物（2n=2x=18），是我國重要的雜糧作物之一。谷子起源于中國，有悠久的栽培歷史，具有耐旱和耐貧瘠的特性，是發掘抗旱基因和研究作物抗旱分子機制的優異種質資源[1]。在擬南芥和水稻中都沒有發現 C4光合作用等重要過程，因此需要新的模式物種[2]。谷子是C4植物，具有生長能力強、CO2利用率高和耐旱等優點，并且具有C4途徑。谷子具有二倍體基因組小、自花授粉和種子產量多等優點，同時谷子突變體xiaomi的發現也解決了谷子生長周期較長和植株較大等不適合作為模式生物研究的問題[3]。并且隨著谷子基因組測序的完成，谷子也逐漸成為一種模式植物[4-5]。

miRNA是一類小RNA（sRNA），是由內源基因編碼、長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA廣泛參與動植物基因轉錄后的基因表達調控，通過與靶 mRNA的靶位點結合抑制基因表達。在植物中，miRNA參與器官建成、生長發育、開花與育性轉換、物質運輸和抗逆響應等多個生理生化過程[6-7]。雖然植物miRNA生物發生、降解、功能及調控機制已得到了較清晰的闡述，但目前關于植物miRNA作用機制的認知仍處于初級階段[8]。谷子抗旱性突出，是研究作物耐旱性的理想模型系統，在干旱脅迫下，14個miRNA被上調，4個miRNA被下調。此外，已鑒定出72個潛在的新miRNA，其中3個在干旱條件下差異表達[9]。miR169是植物中較大的miRNA家族，miRNA數據庫miRBase（http://www.mirbase.org/）已收錄擬南芥、水稻、玉米、大豆、番茄、油菜、大豆、玉米和山核桃等35個物種的400多個miR169基因，這些基因在植物的生長發育及非生物脅迫應答的調控過程中起重要作用。擬南芥miR169家族在脅迫誘導植物開花中起關鍵作用，miR169d在擬南芥中過表達導致提前開花[10]；水稻miR169基因與鹽脅迫應答和干旱誘導相關，還負調控水稻對稻瘟病菌的免疫[11-12]；玉米zma-miR169/ZmNFYA14參與根發育和鹽脅迫應答[13]；大豆miR169基因參與鹽堿和干旱等非生物脅迫應答反應[14-15]；番茄miR169基因能響應致病疫霉菌的侵染[16]；油菜miR169d基因可能通過調控靶基因的表達而參與油菜的早花發育[17]；楊樹miR169基因家族的靶基因包括轉錄因子、蛋白激酶、抗病蛋白和泛素連接酶基因等，說明其廣泛參與楊樹多種生命活動的調控[18]；葡萄miR169的靶基因主要是 NF-YA轉錄因子基因[19]，是葡萄生長發育過程中抗逆境脅迫響應的主要調控因子；山核桃miR169通過作用其下游基因調節花的發育。由于對miR169尚缺乏系統研究，至今僅有部分植物miR169家族成員的功能被解析。

NF-YA轉錄因子基因是miR169的主要靶基因。NF-Y是真核生物中一類廣泛存在的轉錄因子，能夠特異性結合順式作用元件CCAAT-box，進而對其下游靶基因進行正向或負向調控[20]。NF-Y作為保守的轉錄因子在植物的生長發育和對逆境脅迫響應中扮演著重要的角色[21]。NF-Y是1個三聚體轉錄因子，包括NF-YA、NF-YB和NF-YC 3個亞基。NF-YA作為三聚體最為重要的組成因子，在N端富含色氨酸或蘇氨酸，有2個保守域NF-YB/NF-YC結合域和DNA結合域[22]。研究[12]發現，在一些NF-YA基因的3′UTR存在miR169的切割靶位點，miR169可以調控NF-YA基因。擬南芥ath-miR169/NF-YA5調控模塊可以響應干旱，miR169表達受到抑制，NFYA5基因也就脫離了miR169的控制而上調表達，進而使植物抗旱性增強[23]。

miR169家族在植物中主要參與非生物脅迫應答調控，還能誘導植物提前開花等。目前關于谷子miR169（sit-miR169）的相關研究較少。鑒定sitmiR169家族是解析miR169參與谷子生長發育和脅迫響應機制的重要基礎。本文利用生物信息學方法對sit-miR169家族的染色體分布、系統進化、堿基保守性、二級結構和sit-miR169及其靶基因表達情況進行分析，為進一步研究谷子miR169家族的進化和功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 谷子miR169家族的染色體定位分析

從 PmiREN[24]數據庫（http://www.pmiren.com/）下載谷子sit-miR169家族成員的前體序列、成熟序列及染色體定位信息。利用TBtools[25]軟件繪制sitmiR169家族基因的染色體定位圖。

1.2 谷子miR169家族的系統進化分析

利用ClustalX 2.1對谷子sit-miR169前體序列進行多序列比對；從PmiREN數據庫下載水稻和擬南芥miR169的前體序列，對谷子、水稻和擬南芥miR169的前體序列進行多序列比對。利用MEGA X和鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹，Bootstrap值設為1000。

1.3 谷子miR169序列堿基保守性分析

利用WebLogo 3[26]（http://weblogo. threeplusone.com/create.cgi）分析sit-miR169前體序列和成熟序列的堿基保守性。

1.4 谷子miR169前體二級結構預測

利用 RNAfold（http://rna. tbi. univie.ac.at./cgibin/RNAfold.cgi）在線預測sit-miR169前體二級莖環結構，用折疊算法和基本選項選擇最小自由能（MFE）和配分函數。

1.5 谷子miR169組織特異性表達分析

從PmiREN數據庫下載谷子sit-miR169家族成員在根、葉和花中的表達量數據，利用TBtools將sit-miR169的表達數據繪制成熱圖。

1.6 谷子miR169靶基因預測

利用psRNATarget[27]（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）預測靶基因。以自帶 cDNA文庫Setaria italica（foxtail millet）、transcript、JGl genomic project、Phytozome 13、312 v 2.2為搜索數據源預測sit-miR169靶基因，得分模式使用Schema V1（2011 release），Expectation≤3，UPE≤25。將預測得到的靶基因進行整理，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對候選靶基因進行功能注釋。

1.7 谷子miR169靶基因的組織特異性和環境誘導表達分析

從Phytozome數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載上述候選靶基因在不同組織和條件下的表達量數據，并繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 谷子miR169家族基因基本信息及染色體分布

根據PmiREN數據庫，谷子基因組共有15個sitmiR169家族成員（表1）。sit-miR169k和sit-miR169o成熟序列堿基數為20，其余13個sit-miR169成熟序列堿基數均為21。15個sit-MIR169分布在除5和9號染色體外的7條染色體上（圖1），其中位于6號染色體上的sit-miR169最多（5個）。

表1 sit-miR169家族成員的基本信息Table 1 Basic information of sit-miR169 family members

圖1 sit-MIR169基因的染色體定位Fig.1 Chromosome location of sit-MIR169 genes

2.2 谷子miR169家族的系統進化分析

sit-miR169前體序列（sit-MIR169）系統進化分析（圖2）顯示，sit-miR169家族大致可以分為 2簇，sit-MIR169a、sit-MIR169e、sit-MIR169f和sit-MIR169j聚為一簇，其余11個sit-MIR169聚為另一簇。親緣關系較近的sit-MIR169c和sit-MIR169d位于6號染色體的相鄰位置，sit-MIR169h和sit-MIR169i位于2號染色體的相鄰位置，因此它們可能產生于串聯復制。然而親緣關系較近的sit-MIR169a和sit-MIR169e基因并沒有位于同一染色體，說明它們不是通過串聯復制產生。

圖2 sit-miR169家族的系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of sit-miR169 family

對谷子、水稻和擬南芥的miR169家族成員的前體序列進行系統進化分析，結果（圖3）顯示，谷子、水稻和擬南芥的miR169親緣關系較近，尤其是谷子和水稻的部分miR169親緣關系很近，例如sit-MIR169b/osa-MIR169b和sit-MIR169e/osa-MIR169c等。

圖3 谷子、水稻和擬南芥miR169家族系統進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the miR169 family in foxtail millet, rice and Arabidopsis

2.3 谷子miR169序列堿基保守性

sit-miR169前體序列和成熟序列的堿基保守性如圖4所示。15個sit-MIR169前體序列堿基數在88～149，前體序列1-21和104-123位點的堿基保守性較高，其他位點的保守性較低。成熟體基本產生于前體序列中保守性較高的1-21位點。除sit-miR169k和sit-miR169o成熟序列堿基數為20外，其余13個sit-miR169成熟序列堿基數均為21。15個sit-miR169成熟體中17個堿基完全保守，只有3個堿基保守性略低，說明谷子miR169在進化過程中保守性很強。星標序列中第15位堿基完全保守，第11位比較保守，其他位點的堿基保守性較差。

圖4 sit-miR169序列堿基保守性Fig.4 Base conservativeness of sit-miR169 sequences

2.4 谷子miR169前體二級結構預測

sit-miR169a前體sit-MIR169二級結構預測結果（圖5）顯示，15個sit-MIR169均可形成較為穩定的二級莖環結構，且成熟體均產生于前體的5′端臂上，保守性較強。

圖5 sit-MIR169的二級莖環結構Fig.5 Secondary stem-loop structure of sit-MIR169

2.5 谷子miR169組織表達特異性

由圖6可知，sit-miR169g、sit-miR169h、sitmiR169i、sit-miR169j、sit-miR169k、sit-miR169l、sitmiR169m、sit-miR169n和sit-miR169o主要在谷子根部表達，sit-miR169a、sit-miR169b、sit-miR169c、sit-miR169d和sit-miR169e在葉和根中表達量較高，sit-miR169f在花中優勢表達。結果表明，sit-miR169廣泛參與谷子各器官和組織的生長發育。

圖6 sit-miR169在不同組織中的表達情況Fig.6 Expression of sit-miR169 in different tissues

2.6 谷子miR169靶基因預測

靶基因預測（表2）顯示，谷子miR169靶基因編碼的蛋白質大多是 NF-YA轉錄因子家族成員，除此之外，還有L型凝集素類受體蛋白激酶、ω-6脂肪酸去飽和酶、轉運蛋白Sec1a、SDG40蛋白、環指跨膜蛋白和核糖體大亞基假尿苷合酶SVR1。NF-Y是一類結合CCAAT-box的重要轉錄因子，包括3個亞基NF-YA、NF-YB和NF-YC。所有sitmiR169的靶基因都有NF-YA，說明NF-YA亞基基因是sit-miR169最主要的靶基因。谷子miR169靶基因中的NF-YA家族成員有NF-YA1、NF-YA4、NFYA5、NF-YA7和NF-YA10。

表2 谷子miR169靶基因預測Table 2 Prediction of miR169 target genes in foxtail millet

2.7 谷子miR169靶基因的組織特異性和環境誘導表達分析

miR169通過調控靶基因，尤其是NF-YA的表達量來影響植物的生長發育和對環境的應答。谷子miR169靶基因NF-YA主要在根和穗中表達（圖7），表現出明顯的組織表達特異性，表明其可能主要參與調控谷子根和穗部的生長發育。Seita.2G037100和Seita.2G383900在穗中優勢表達，其蛋白質序列相似度為52%，推測這2個基因可能是產生于串聯復制的同源基因，其編碼的 NF-YA轉錄因子可能具有相似功能。

圖7 sit-miR169靶基因在不同組織和環境誘導條件下的表達情況Fig. 7 Expression of sit-miR169 target genes in different tissues and environment conditions

基因表達數據（圖7）表明，sit-miR169靶基因的表達受環境誘導，例如Seita.1G338100、Seita.3G390000、Seita.9G129400、Seita.9G367200和Seita.9G521100基因在根中都有較高表達，但在不同環境誘導條件下的根中表達量表現出顯著差異。根中Seita.1G338100表達量在光照處理下最高，在氨或硝酸鹽處理下次之，在尿素處理下最低；而Seita.3G390000在尿素處理下最高，在氨或硝酸鹽處理下次之。Seita.9G521100在光照、尿素、氨或硝酸鹽處理下根中表達量差異不顯著，但在干旱條件下根中表達量較高，說明干旱能誘導其在根中穗的表達。

3 討論

谷子是我國古老的傳統抗旱、耐貧瘠作物。目前全球水資源缺乏，化肥施用過度，谷子在現代農業綠色發展中的重要作用日益突顯。小米具有保健功能，受到越來越多的關注，谷子研究和小米產業迎來新的機遇。microRNA是一小段非編碼單鏈RNA，參與復雜的基因表達調控，控制著植物的發育程序，并參與生物和非生物脅迫應答過程。miR169是植物中較為龐大和保守的miRNA家族之一。miR169在一些植物中的功能已經得到初步的研究，其能廣泛參與植物的逆境脅迫響應（如鹽堿、干旱脅迫及致病疫霉菌侵染）和生長發育調控（如開花調控、花和根發育）[10-19]。谷子miR169的靶基因大多是NF-YA轉錄因子基因，miR169通過調控靶基因，尤其是NF-YA的表達量影響植物的生長發育和環境應答反應。鑒定并分析miR169家族對解析miR169家族成員在植物生長發育及逆境脅迫響應中的功能具有重要意義[28]。

本研究表明，谷子基因組共有15個sit-miR169家族成員，系統進化分析顯示，sit-miR169大致分為2簇，部分sit-MIR169成員可能產生于串聯復制（如sit-MIR169c和sit-MIR169d、sit-MIR169h和sit-MIR169i）。sit-miR169成熟序列堿基保守性很高，星標序列堿基保守性較低。sit-miR169家族成員均能形成較穩定的二級莖環結構，成熟序列位于 5′端。sit-miR169廣泛參與谷子各個器官和組織的生長發育。sit-miR169靶基因包括NF-YA轉錄因子、L型凝集素類受體蛋白激酶、ω-6脂肪酸去飽和酶、轉運蛋白Sec1a、SDG40蛋白、環指跨膜蛋白和假尿苷合酶 SVR1基因等，其中最主要的是NF-YA基因。sit-miR169k和sit-miR169o分別位于3和8號染色體，在sit-miR169家族成員中只有sitmiR169k和sit-miR169o的成熟序列堿基數目是20，并且成熟序列完全相同。sit-miR169k和sit-miR169o的靶基因有環指跨膜蛋白、假尿苷合酶SVR1和ω-6脂肪酸去飽和酶基因，與其他sit-miR169家族成員截然不同，這表明二者同源性較高，可能具有相同功能。谷子NF-YA基因主要在根和穗中表達，表現出明顯的組織表達特異性。Seita.2G037100和Seita.2G383900在穗中優勢表達，其蛋白質序列相似度為52%，推測二者可能是產生于串聯復制的同源基因，其編碼的 NF-YA轉錄因子可能具有相似功能。sit-miR169靶基因的表達受環境誘導，如干旱條件能進一步誘導Seita.9G521100基因在根中的表達。

谷子和水稻同為單子葉禾本科二倍體作物，在進化上具有較近的親緣關系[4]，遺傳圖譜比較顯示，谷子與水稻的基因組序列有很高的保守性[29]。本文對谷子、水稻和擬南芥miR169進行系統發育分析，結果顯示，谷子和水稻的部分miR169親緣關系很近，例如sit-MIR169b/osa-MIR169b和sit-MIR169e/osa-MIR169c等。在水稻中，miR169與鹽脅迫應答、干旱誘導相關，參與負調控水稻對稻瘟病菌的免疫[11-12]。例如osa-miR169g是osa-miR169家族中唯一能被干旱誘導的成員，它的啟動子上游區域有2個相鄰的DRE（干旱響應元件），表明其可能直接受 CBF/DREB轉錄因子的調控，在水稻干旱響應中扮演重要角色[12]。谷子抗旱性和節水性突出，是研究抗旱調控機制的重要作物，然而與水稻、玉米等其他禾本科作物相比，谷子抗逆研究較為滯后，模式植物水稻miR169的研究可以為谷子提供很好的思路。

miR169與靶基因共同調控植物生長發育的各個方面，miR169與靶基因調控模塊研究為miRNA功能分析提供了思路。例如miR169/NF-YA調控模塊對植物的發育和逆境響應起著重要作用，miR169/NF-YA參與逆境誘導早花調控[30]。部分sit-miR169及其靶基因的組織表達部位具有一致性，sitmiR169a、sit-miR169b、sit-miR169c、sit-miR169d和sit-miR169e主要在葉片中表達，它們親緣關系較近。它們的主要靶基因為轉運蛋白、NF-YA轉錄因子和L型凝集素類受體蛋白激酶基因，其中L型凝集素類受體蛋白激酶基因主要在葉片中表達，這與sit-miR169a-sit-miR169e的組織表達部位一致，因此sit-miR169a-sit-miR169e可能參與葉片中L型凝集素類受體蛋白激酶基因的表達調控。sit-miR169f在花中優勢表達，其靶基因Seita.2G037100（NF-YA10-1）和Seita.2G383900（NF-YA4-1）在穗中優勢表達，因此sit-miR169f與Seita.2G037100、Seita.2G383900可能共同參與花發育調控。此外，所有sit-miR169靶基因都有NF-YA基因，NF-YA主要在根和穗部中表達，因此sit-miR169與NF-YA可能共同參與谷子根和穗部發育調控。除NF-YA基因外，miR169的靶基因還包括ω-6脂肪酸去飽和酶基因，植物脂肪酸組成很大程度上受到脂肪酸去飽和酶種類和數量的調控，深入了解脂肪酸去飽和酶的種類、數量及其編碼基因對于定向改變植物的脂肪酸組成具有重要的理論和實際意義[31]，這些靶基因的研究為miR169作用機制分析奠定了理論基礎。

4 結論

在谷子全基因組水平上鑒定了15個sit-miR169，sit-MIR169前體進化樹大致分為2簇，其中部分sitmiR169與水稻的miR169親緣關系較近。sit-miR169家族成員的成熟序列堿基保守性高，星標序列堿基保守性較低。15個sit-MIR169均可形成較為穩定的二級莖環結構，成熟體產生于5′端。

sit-miR169廣泛參與谷子各組織的生長發育。谷子miR169靶基因有NF-YA轉錄因子、L型凝集素類受體蛋白激酶、ω-6脂肪酸去飽和酶、轉運蛋白Sec1a、SDG40蛋白、環指跨膜蛋白和核糖體大亞基假尿苷合酶SVR1的基因，其中NF-YA轉錄因子基因最多。谷子NF-YA基因主要在根和穗中表達。