桃紅四物湯對兔軟骨損傷模型Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)的影響

孫云柯 李益亮 姚金龍 孫紹裘

[摘要]目的探討桃紅四物湯對不同程度兔軟骨損傷模型Smadl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)的影響，從而闡明桃紅四物湯干預(yù)Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)作用機(jī)制。方法將40只健康新西蘭大白兔，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)的方法平均分成四組，分別為桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組、模型組和正常對照組，每組各10只。對桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組和模型組進(jìn)行軟骨損傷造模，術(shù)后分別以桃紅四物湯、氨基葡萄糖對對應(yīng)組灌胃，模型組、正常對照組灌服等量生理鹽水，并于灌胃后4周、6周兩個(gè)時(shí)限，從每組隨機(jī)抽取5只實(shí)驗(yàn)兔，麻醉后抽取腹主動(dòng)脈血，并按原手術(shù)切口切開后暴露損傷軟骨，進(jìn)行大體觀察，并切取包括股骨下端在內(nèi)的關(guān)節(jié)面，檢測Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)情況，予以統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果桃紅四物湯組平均血清Smad1濃度明顯高于氨基葡萄糖組、模型組，但是低于正常對照組;WB檢測的平均灰度值測定第4周時(shí)低于氨基葡萄糖組，但明顯高于模型組，第6周時(shí)則高于氨基葡萄糖組;各組大白兔關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色病理觀察，第4周與第6周差異不大。結(jié)論桃紅四物湯能上調(diào)軟骨損傷模型大白兔Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)，并且上調(diào)效果優(yōu)于氨基葡萄糖。

[關(guān)鍵詞]桃紅四物湯;氨基葡萄糖;軟骨損傷;Smadl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白

[中圖分類號]R285.5??? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0020-05

Effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of Smadl signal transduction protein in rabbit model with cartilage injury

SUN Yunke1，2??? LI Yiliang1??? YAO Jinlong1?? ?SUN Shaoqiu2

l.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China;2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410005，China

[Abstract]Objective To explore the effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of Smad1 signal transduction protein in rabbit model with cartilage injury of different degrees，so as to clarify the mechanism of Taohong Siwu decoction intervening the expression of Smad1 signal transduction protein and promoting cartilage injury repair. Methods A total of 40 healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups after adaptive feeding for 1 week，namely Taohong Siwu Decoction group，glucosamine group，model group and normal control group，with 10 rabbits in each group. The models with cartilage injury were made in Taohong Siwu Decoction group，glucosamine group and model group. After operation，Taohong Siwu Decoction and glucosamine were given to the corresponding groups respectively，and the model group and normal control group were given the same amount of normal saline. Five experimental rabbits were randomly selected from each group within four weeks and six weeks after gastric perfusion. After anesthesia，abdominal aorta blood was collected. The injured cartilage was exposed observed generally throng cutting the original surgical incision，and the articular surface，including the lower end of the femur，was incised，and the expression of Smad1 signal transduction protein was detected and statistically analyzed. Results The average concentration of serum Smad1 in Taohong Siwu Decoction group was significantly higher than that in glucosamine group and model group，but lower than that in normal control group. Western Blot （WB）detection showed that the average gray value in Taohong Siwu Decoction group was lower than that of glucosamine group at the 4th week，but significantly higher than that of model group，and higher than that of glucosamine group at the 6th week. Pathological observation of articular cartilage tissue of rabbits in each group by hematoxylin-eosin （HE）staining showed little difference between the 4th week and 6th week. Conclusion Taohong Siwu Decoction can up-regulate the expression of Smad1 signal transduction protein in rabbit model of cartilage injury and promote the repair of cartilage injury，and the up-regulation effect is better than glucosamine.

[Key words] Taohong Siwu Decoction;Glucosamine;Cartilage injury;Smad1 signal transduction protein

軟骨損傷根據(jù)損傷深度的差異可分為以下兩類：部分厚度的軟骨損傷和全層關(guān)節(jié)軟骨損傷，前者為缺骨鈣化層，后者則為缺損超過軟骨鈣化層[1]。按照國際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)（International Cartilage Repair Society，ICRS）分級法來劃分：0級表示為正常關(guān)節(jié)軟骨;I級體現(xiàn)為軟骨腫脹、軟化;II級即軟骨表面缺損<軟骨全層的50%;III級則為軟骨表面缺損超過全層的50%，軟骨下骨未顯露;IV級為全層軟骨損傷，表現(xiàn)為軟骨下骨裸露甚至缺損[2]。現(xiàn)階段普遍認(rèn)為軟骨能夠修復(fù)的程度與其損傷的類型有關(guān)，<2.0 mm的損傷通常會(huì)觀察到相似于正常透明軟骨的修復(fù)組織;軟骨缺損的直徑>3 mm則很難完全修復(fù);直徑>6 mm的全層軟骨損傷不僅無法修復(fù)，還會(huì)進(jìn)一步累及到周圍的骨質(zhì)和軟骨，從而使缺損面積進(jìn)一步擴(kuò)大，繼續(xù)發(fā)展還可引起損傷周邊的軟骨出現(xiàn)下滑甚至塌陷[3]。

在我國傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中暫無獨(dú)立的對關(guān)節(jié)軟骨損傷這類病證的研究，中醫(yī)講“筋”包括關(guān)節(jié)軟骨;筋附著于骨的表面，因而筋與骨兩者之間的關(guān)系緊密且相互影響;因而將關(guān)節(jié)軟骨損傷歸類于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的“筋傷”“骨痹”的范疇[4]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為軟骨損傷后，損傷局部首先會(huì)出現(xiàn)氣滯血瘀，經(jīng)絡(luò)的氣血循行受阻，進(jìn)而影響了軟骨正常的營養(yǎng)供應(yīng)，局部軟骨組織失去濡養(yǎng)，最終導(dǎo)致機(jī)體的功能出現(xiàn)異常，從而引發(fā)一系列病理改變。因此，本項(xiàng)目組認(rèn)為軟骨損傷的病機(jī)多為氣滯血瘀。

1??? 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1??? 動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)選取雌雄新西蘭大白兔各20只，10～12月齡，體重2.5～3 kg/只，共40只，由本大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一購買[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證SCXK（湘）2020- 0005]。隨機(jī)分為桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組、模型組和正常對照組，各組大白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始進(jìn)行造模，其中除正常對照組只切開皮膚進(jìn)行假手術(shù)外，其余各組均按下文所述造模方法進(jìn)行造模。

1.2??? 灌胃試劑制備

桃紅四物湯：參照《醫(yī)宗金鑒》[5]中桃紅四物湯的方藥組成，桃仁20 g、川芎10 g、當(dāng)歸20 g、紅花10 g、赤芍20 g、生地黃20 g。中藥材均按《中華人民共和國藥典》[6]所載道地藥材的指定主產(chǎn)地由本大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科一次購進(jìn)，由煎藥房代煎，水煎制成含生藥4 g/ml的湯劑，并置于冰箱冷藏。桃紅四物湯灌胃劑量的計(jì)算：根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算公式，予以4.7 g/kg灌胃。

氨基葡萄糖：選用鹽酸氨基葡萄糖片（正大清江制藥，國藥準(zhǔn)字H20060647，規(guī)格：0.75 g×30片），充分研磨，溶于水中，配置成濃度為0.015 g/ml的溶液。氨基葡萄糖灌胃劑量的計(jì)算：根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算公式，予以0.07 g/kg灌胃。

1.3??? 造模方法

實(shí)驗(yàn)大白兔禁食水6 h以后，整理好手術(shù)器械，消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)，準(zhǔn)備造模。準(zhǔn)備電子秤，稱取重量，抓取大白兔，消毒后用5 ml的注射器按體重3.5 ml/kg抽取相應(yīng)10%水合氯醛緩慢行腹腔麻醉，注射過程中注意回抽，無血方能繼續(xù)注射，避免水合氯醛直接入血，導(dǎo)致大白兔死亡。當(dāng)大白兔出現(xiàn)肌肉松弛，且角膜反射消失后即表示深入麻醉，麻醉成功，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)作溫柔輕緩，并注意觀察大白兔胸廓起伏情況，確保實(shí)驗(yàn)大白兔的生命體征平穩(wěn)。大白兔取仰臥位，用固定器將實(shí)驗(yàn)大白兔固定于手術(shù)臺(tái)，充分暴露術(shù)野，首先對手術(shù)區(qū)域進(jìn)行備皮，切口選擇膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，依次切開皮膚、分離皮下筋膜，找到髕骨內(nèi)側(cè)緣，以此為切口切開膝關(guān)節(jié)，牽拉肌腱，充分暴露關(guān)節(jié)區(qū)域，在股膝關(guān)節(jié)槽處進(jìn)行手術(shù)造模，其中部分軟骨損傷采用刀片輕輕地刮蹭軟骨表面;全層軟骨損傷則用刀片去掉全部的軟骨，并輕輕刮擦下骨板;骨軟骨損傷則選用手搖鉆，鉆孔穿透軟骨下骨，深度為3.5～4 mm。所有缺損直徑均約4 mmo造模結(jié)束后對關(guān)節(jié)囊、肌肉筋膜組織嚴(yán)密縫合，最后縫合皮膚，對齊皮緣。術(shù)畢碘伏消毒，術(shù)后禁食6 h后標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂養(yǎng)。

1.4??? 實(shí)驗(yàn)儀器

移液器Finnpipette，20～200μl（德國艾本德公司）;培養(yǎng)箱37°（一恒蘇凈科學(xué)公司）;洗板機(jī)Tianshi，988洗板機(jī)（拓普分析儀器）;酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)公司）;離心機(jī)：微量高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）;冷凍離心機(jī)：TGL16M（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;恒溫?fù)u床（赫田科學(xué)儀器公司）;攪拌器：81-2恒溫磁力攪拌器（世紀(jì)科信科學(xué)儀器公司）。

1.5??? 檢測標(biāo)本制備

含藥血清的制備：參考實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。桃紅四物湯組給予每日桃紅四物湯4.7 g/kg灌胃，分為早上9點(diǎn)和下午4點(diǎn)兩次灌胃;氨基葡萄糖組給予每日氨基葡萄糖0.07 g/kg灌胃，分為早上9點(diǎn)和下午4點(diǎn)兩次灌胃;模型組與正常對照組分別予以等量的生理鹽水灌胃。后分別于第4周、第6周抽取大白兔腹主動(dòng)脈血，離心后置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

骨標(biāo)本制備：切取包括股骨下端在內(nèi)的關(guān)節(jié)面，然后予以股骨頭進(jìn)行切片、固定、包埋、染色等處理后，置于顯微鏡下觀察，余下骨組織進(jìn)行WB 檢測。

1.6??? 標(biāo)本檢測方法

含藥血清中Smad1酶聯(lián)免疫分析：各標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，設(shè)置空白孔和待測品孔。在酶標(biāo)包被板上待測品孔中加入樣品稀釋液40 μl，再加入待測品10 μl（最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，注意不觸及孔壁，最后輕輕搖勻。經(jīng)加酶、溫浴、配液、洗滌后加入顯色劑A 50 μl，第二步為入顯色劑B 50 μl，搖勻，避光顯色15 min（溫度37℃），最后加入種植液，空白孔調(diào)零，測量各孔的OD值。

Western Blotting檢測：對各組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)收集，提取蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度，之后按照Western Blotting法制膠、準(zhǔn)備、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、顯色、曝光，檢測Smadl信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)水平。

HE染色：骨標(biāo)本脫鈣后，將切片放置恒溫箱（60℃）烤片1～2 h，之后二甲苯浸泡10 min，浸泡2次，再依次在100%、100%、95%、85%和75%梯度乙醇中，放置5 min，蒸餾水浸洗5 min后用蘇木素浸染10 min，沖洗后PBS返藍(lán)，伊紅浸染5 min后沖洗;最后梯度乙醇（95%～100%）脫水各5 min，再置于二甲苯10 min，2次，予中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.7??? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，多組間差異性分析采用方差檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，配對資料兩組間差異性分析采用配對樣本t檢驗(yàn)，定義檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??? 結(jié)果

2.1??? 各組股骨下端的關(guān)節(jié)面進(jìn)行大體觀察

對照組軟骨面光滑平整，全層形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，其余各組關(guān)節(jié)面均不平整，其中桃紅四物湯與氨基葡萄糖兩組軟骨修復(fù)情況均明顯優(yōu)于模型組，且桃紅四物湯對骨軟骨損傷模型的修復(fù)表現(xiàn)優(yōu)于其他兩類軟骨損傷模型。

2.2??? Western Blotting對于各組標(biāo)本中Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白水平的表達(dá)

第4周時(shí)桃紅四物湯組低于氨基葡萄糖組，第6周時(shí)則高于氨基葡萄糖組（P<0.05），兩組均低于正常對照組，但均高于模型組（P<0.05）。見圖1及表1。

2.3??? 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清樣本Smad1酶聯(lián)免疫分析

第4周、第6周桃紅四物湯組均高于氨基葡萄糖組（P<0.05），兩組均低于正常對照組，但均高于模型組（P<0.05）。見表2。

2.4??? 關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色病理觀察

桃紅四物湯組表面區(qū)不平整，高低不平，軟骨基質(zhì)增生，膠原纖維增生，輻射層軟骨細(xì)胞減少，血管侵犯潮線;氨基葡萄糖組表面區(qū)不平整，高低不平，軟骨基質(zhì)增生，膠原纖維增生，血管侵犯潮線;模型組移行區(qū)軟骨細(xì)胞含量降低，雙重潮線;對照組表面區(qū)光滑平整，全層形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，潮線明顯。第4、6兩周各組對比差異不大。見圖2。

3??? 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）通過經(jīng)典和非經(jīng)典兩類Smad信號通路來發(fā)揮調(diào)控誘導(dǎo)作用[7]，其中Smads蛋白作為BMP下游中重要的經(jīng)典信號蛋白，具有不同的特性[8]，根據(jù)其不同特性可分為以下幾類，第1類包括Smad1、2、3、5、8;其中Smad2、Smad3稱為受體活化型，可傳遞TGF-B 信號，而Smad1、5、8則可與受體形成復(fù)合物相結(jié)合并使其磷酸化，介導(dǎo)BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。第2類為Co-Smads，即Smad4，它可同時(shí)存在BMPs和TGF-P 信號通路中，為合作關(guān)系[10]。第3類為I-Smads，包括Smad6、7。I-Smads不能被受體磷酸化，但可與R-Smads競爭，阻止其磷酸化，起到負(fù)調(diào)控作用。

Smad1作為BMP信號傳遞過程中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，其下游在BMP信號傳遞過程中起到重要作用的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子為Runx2、Sox9，二者均與調(diào)控成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的分化關(guān)系密切[11]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠Smad1基因后，小鼠骨量下降且出現(xiàn)顱骨發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，BMP信號通路被抑制[12]。

綜上所述，BMP-Smad信號通路與軟骨再生具有密切的聯(lián)系，且Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白作為信號通路中重要的蛋白，其表達(dá)對促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)有著重要意義，對促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化有著重要的作用。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中并無單一對關(guān)節(jié)軟骨缺損病證的認(rèn)識研究，關(guān)節(jié)軟骨在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中歸屬于“筋”;骨與筋相互聯(lián)系、相互影響;因此關(guān)節(jié)軟骨損傷在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中可診斷為“筋傷”“骨痹”[13]。中醫(yī)骨傷認(rèn)為軟骨損傷后，損傷局部會(huì)出現(xiàn)氣滯血瘀的表現(xiàn)，經(jīng)絡(luò)氣血循行障礙;局部組織失去營養(yǎng)供應(yīng)，正常的生理功能出現(xiàn)異常。氣血虧虛，不能充盈血脈，氣無以帥血正常達(dá)于四肢關(guān)節(jié)，脈絡(luò)運(yùn)行無力，駐留于關(guān)節(jié)化為瘀血，關(guān)節(jié)失養(yǎng)，瘀血阻滯經(jīng)絡(luò)，痹阻關(guān)節(jié)，不通則痛。此“痹久必有瘀血”;痹病日久，加之風(fēng)寒濕邪侵襲經(jīng)絡(luò)，氣血不能貫通暢行，痹阻經(jīng)絡(luò)，瘀結(jié)而發(fā)為痹痛[14]。活血化瘀法為治療痹證的基本方法，桃紅四物湯作為活血化瘀的代表方之一，其有效性在臨床上已得到了證實(shí)。

研究表明活血化瘀藥物內(nèi)服可以明顯升高骨折局部骨組織中BMP-7、Smad1、Smad5mRNA的表達(dá)水平[15]，而Smad1、5與軟骨再生修復(fù)密切相關(guān)[16]。段洪超等[17]研究發(fā)現(xiàn)丹參注射液可修復(fù)退變軟骨，減少軟骨細(xì)胞凋亡，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。余毅[18]研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀中藥能有效緩解軟骨細(xì)胞的破壞程度。劉獻(xiàn)祥等[19]發(fā)現(xiàn)用透骨消痛顆粒含藥血清可以促進(jìn)Sox9m RNA等因子的表達(dá)，陳國茜等[20]研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀含藥血清可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響MSCs的軟骨分化，以上研究均在一定程度上進(jìn)一步證明了活血化瘀藥物對促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)的作用。

該實(shí)驗(yàn)以不同程度軟骨損傷模型大白兔為研究對象，對各組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行檢測分析，實(shí)驗(yàn)表明桃紅四物湯能上調(diào)軟骨損傷模型大白兔Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)，并且上調(diào)效果總體優(yōu)于氨基葡萄糖，第4周、第6周各組間無明顯差異;大體觀察顯示桃紅四物湯極有可能對骨軟骨損傷模型的修復(fù)效果更好。本實(shí)驗(yàn)從分子層面再次證明了桃紅四物湯對軟骨損傷修復(fù)的作用，并在一定程度上闡述了Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)的作用機(jī)制，但受到組別樣本數(shù)量的限制，其確切機(jī)制以及桃紅四物湯的最適軟骨損傷模型仍需進(jìn)一步研究。

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