CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與卵巢癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

王玎，李志英，李會(huì)，盧嬌

1 三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院婦科，湖北宜昌443001；2 三峽大學(xué)婦科腫瘤研究所

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020 年全球卵巢癌新發(fā)病例約31.4 萬(wàn)例，死亡病例約20.8 萬(wàn)例［1］。在婦科三大惡性腫瘤中，卵巢癌的預(yù)后最差，其原因?yàn)槁殉舶┪恢蒙钤冢l(fā)病隱匿，臨床確診時(shí)多處于晚期，并且卵巢癌惡性程度高、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。目前，卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，至今仍缺乏有效的早期診斷方法。表觀遺傳學(xué)改變與正常的生理過(guò)程和疾病的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系。DNA 甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳學(xué)修飾方式。有研究報(bào)道，抑癌基因異常甲基化在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中扮演重要角色［2-3］。鈣黏蛋白13（CDH13）和原鈣黏蛋白8（PCDH8）均為鈣離子依賴(lài)性細(xì)胞黏附分子，可參與細(xì)胞間識(shí)別和黏附過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)［4-5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化與非小細(xì)胞肺癌和肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6-7］，而PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化與前列腺癌和腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8-9］。但CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與卵巢癌的關(guān)系尚不明確。本研究觀察了CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與卵巢癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015 年1 月—2016 年6 月三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院收治的卵巢癌患者203 例。所有患者經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥18 歲；③初診；④接受根治性或姑息性手術(shù)且術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤者；②合并全身感染性疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者；④合并自身免疫性疾病者。患者年齡27～73（47.58 ±9.54）歲，其中≥55歲67例、＜55歲136例；腫瘤直徑：

≥4 cm 119例，＜4 cm 84例；組織分化程度：低分化55例，中高分化148 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期86 例，Ⅲ、Ⅳ期117 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移91 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移112例。本研究經(jīng)三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：20210016），患者或其家屬知情同意并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 CDH13、PCDH8 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。將手術(shù)切除的卵巢癌組織及其配對(duì)的癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm，經(jīng)病理檢查明確為正常卵巢組織），液氮中速凍。取凍存的卵巢癌組織與癌旁正常組織，剪碎后置于研缽中，液氮下充分研磨成粉末，加入RIPA裂解液提取組織總蛋白。經(jīng)BCA 法蛋白定量合格后，加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白20 μg，SDSPAGE 分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h 后，加入兔抗鼠CDH13、PCDH8、β-actin 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入FIFC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗，37 ℃孵育4 h。最后ECL顯色，暗室中曝光、顯影和定影。Tanon GIS-1000 數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)檢測(cè) 采用甲基化特異性PCR 法。取凍存的卵巢癌組織與癌旁正常組織，剪碎后置于研缽中，液氮下充分研磨成粉末。采用基因組DNA 提取試劑盒抽提基因組DNA，亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 后，分別采用CDH13、PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化引物與非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列由北京天根生化科技有限公司設(shè)計(jì)合成。CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化引物：上游引物5′-TCGCGGGGTTCCTTTTTCGC-3′、下游引物5′-GACGTTTTCATTCATACACGCG-3′，非甲基化引物：上游引物5′-TTGTGGGGTTGTTTTTTGT-3′、下 游 引 物5′-AACTTTTCATTCATACACACA-3′；PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化引物：上游引物5′-CTTATAAAGGTAAAGGCGGC-3′、下游引物5′-AAATCAGGCTCATTACGAAC-3′，非甲基化引物：上游引物5′-GGTTAGAAAGGTAAAGGTGG-3′、下游引物5′-AAAATCACACTCTTTACAAA-3′。PCR 反 應(yīng) 體系共20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，RNase-free 6 μL；反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃45 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。Marker 選擇DS2000，以甲基化酶處理的基因組DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照，以水代替DNA作為空白對(duì)照。甲基化陽(yáng)性：甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶；甲基化陰性：甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶。

1.4 隨訪 所有患者出院后定期隨訪5 年，以患者死亡為終點(diǎn)，隨訪截至2021年6月或患者死亡，記錄患者生存情況，計(jì)算5年累積生存率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析采用多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織與癌旁正常組織CDH13、PCDH8蛋白表達(dá)比較 卵巢癌組織CDH13、PCDH8 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.56 ± 0.18、2.21 ± 0.54，癌旁正常組織分別為1.18±0.33、3.02±0.63。卵巢癌組織CDH13、PCDH8蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁正常組織（t分別為-15.754、-11.666，P均＜0.01）。

2.2 卵巢癌組織與癌旁正常組織CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)比較 卵巢癌組織CDH13、PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率分別為62.56%（127/203）、75.86%（154/203），癌旁正常組織分別為8.87%（18/203）、7.88%（16/203）。卵巢癌組織CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率均高于癌旁正常組織（χ2分別為127.459、192.718，P均＜0.01）。

2.3 CDH13、PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.4 CDH13、PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 截至2021 年6 月，共隨訪5～60 個(gè)月、中位隨訪時(shí)間42 個(gè)月，隨訪期間死亡77 例。卵巢癌組織CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性患者5年累積生存率為56.69%，卵巢癌組織CDH13基因啟動(dòng)子甲基化陰性患者5 年累積生存率為71.05%，卵巢癌組織CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性患者5年累積生存率低于卵巢癌組織CDH13基因啟動(dòng)子甲基化陰性患者（χ2=11.087，P＜0.05）。卵巢癌組織PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性患者5 年累積生存率為58.44%，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陰性患者5 年累積生存率為73.47%，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性患者5 年累積生存率低于卵巢癌組織PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陰性患者（χ2=14.796，P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2。

圖1 卵巢癌組織不同CDH13基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)患者的生存曲線

圖2 卵巢癌組織不同PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)患者的生存曲線

2.5 卵巢癌患者預(yù)后不良的影響因素分析 卵巢癌患者死亡者與存活者臨床病理資料比較見(jiàn) 表2。

表2 卵巢癌患者死亡者與存活者臨床病理資料比較［例（%）］

以卵巢癌患者預(yù)后（死亡=1，存活=0）為因變量，以年齡（≥55 歲=1，＜55 歲=0）、TNM 分期（Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=1，無(wú)=0）、CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)（陽(yáng)性=1，陰性=0）、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)（陽(yáng)性=1，陰性=0）為自變量，納入多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性、PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性均為卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 卵巢癌患者預(yù)后不良的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果

3 討論

卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但其病死率卻高居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌早期5年生存率超過(guò)90%，但卵巢癌早期癥狀不明顯，約70%患者確診時(shí)已處于晚期，而卵巢癌晚期5 年生存率僅30%左右［10-11］。目前，卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，至今仍缺乏有效的早期診斷方法。表觀遺傳學(xué)是研究除DNA 序列變化外的其他機(jī)制引起的細(xì)胞表型和基因表達(dá)的可遺傳改變，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)、非編碼RNA 調(diào)控等。表觀遺傳變異具有可逆性。因此，表觀遺傳學(xué)藥物能夠?yàn)閻盒阅[瘤提供新的治療策略［2］。DNA 甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳學(xué)修飾方式。轉(zhuǎn)錄活躍基因啟動(dòng)子上游區(qū)域DNA 甲基化可導(dǎo)致選擇性基因沉默，當(dāng)抑癌基因沉默時(shí)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等［12］。

CDH13 又稱(chēng)T-鈣黏蛋白、H-鈣黏蛋白，是非典型鈣黏蛋白家族成員之一。CDH13 具有常見(jiàn)的鈣黏蛋白細(xì)胞外區(qū)的所有特征，但缺少跨膜結(jié)構(gòu)和典型的細(xì)胞質(zhì)區(qū)序列，能夠通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定于質(zhì)膜外表面，從而在細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用［13］。CDH13 廣泛分布于正常細(xì)胞表面，但在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，可作為抑癌基因參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［14-15］。XU 等［14］研究報(bào)道，胰腺癌組織CDH13表達(dá)顯著下調(diào)，異種移植過(guò)表達(dá)CDH13 能夠通過(guò)抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。WANG 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌和肺癌組織CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性明顯升高，通過(guò)DNA 聚合酶β增強(qiáng)CDH13蛋白表達(dá)后，乳腺癌和肺癌細(xì)胞侵襲、遷移能力明顯受到抑制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織CDH13 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，提示在卵巢癌組織中CDH13 蛋白表達(dá)受到抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織CDH13基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織，并且CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明卵巢癌組織CDH13 基因高度甲基化，CDH13 蛋白表達(dá)受到抑制，并且CDH13 蛋白低表達(dá)與卵巢癌惡性進(jìn)展有關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性患者5年累積生存率低于卵巢癌組織CDH13基因啟動(dòng)子甲基化陰性患者，說(shuō)明CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化可能與卵巢癌患者預(yù)后有關(guān)；進(jìn)一步通過(guò)多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析發(fā)現(xiàn)，CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性是卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CDH13 基因啟動(dòng)子甲基化有可能成為預(yù)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

原鈣黏蛋白是鈣黏蛋白超家族中最大的一個(gè)亞群，PCDH8 為原鈣黏蛋白家族成員之一。以往研究多關(guān)注PCDH8 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系。近年研究發(fā)現(xiàn)，PCDH8 異常表達(dá)還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［16-17］。孫良璋等［16］研究報(bào)道，肺癌組織PCDH8蛋白表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)PCDH8蛋白表達(dá)能夠通過(guò)抑制蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活，抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。YE等［17］研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織PCDH8 蛋白表達(dá)下調(diào)，上調(diào)PCDH8 蛋白表達(dá)能夠通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路激活，從而發(fā)揮抑癌作用。雖然上述研究并未分析腫瘤組織PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化情況，但均發(fā)現(xiàn)腫瘤組織PCDH8 蛋白表達(dá)下調(diào)。近年謝小紅等［18］研究報(bào)道，PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織PCDH8 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，說(shuō)明卵巢癌組織PCDH8蛋白表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織，并且PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示卵巢癌組織PCDH8基因高度甲基化，PCDH8蛋白表達(dá)受到抑制，從而促進(jìn)卵巢癌惡性進(jìn)展。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性患者5年累積生存率低于卵巢癌組織PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陰性患者，說(shuō)明PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化可能與卵巢癌患者預(yù)后有關(guān)；進(jìn)一步通過(guò)多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析發(fā)現(xiàn)，PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性為卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化有可能成為預(yù)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

綜上所述，卵巢癌組織CDH13、PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性明顯升高，并且與腫瘤TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)。但本研究?jī)H觀察了卵巢癌組織CDH13、PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，二者在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。