實時熒光PCR在檢測雞精中雞源性成分中的應用

陳欣　周正海　尹露　付莎莉　王利剛

摘要：為監測雞精中雞源性成分情況，文中設計了一套特異性的探針和引物，使用實時熒光PCR，對市售的30種雞精樣品進行雞源性檢測。其中，能檢測出雞源性成分的樣品28個，未能檢測出雞源性成分的樣品2個。實驗結果顯示，設計的特異性探針和引物在給定的擴增條件下可以在較短時間內檢測出雞精中的雞源性成分，具有操作簡便快捷，檢出靈敏度高，擴增特異性強等優點，方法可用于雞精中雞源性的檢測，為市場監管部門開展風險監測提供技術支撐。

關鍵詞：實時熒光PCR;雞精;雞源性成分

Application of Real-time PCR in the Detection of Chicken-derived Components in Chicken Essence

CHEN Xin ZHOU Zheng-Hai YIN Lu FU Sha-Li WANG Li-Gang

Abstract：In order to monitor whether chicken essence contains chicken derived components， a set of specific probes and primers were designed. Real-time PCR was used to detect 30 kinds of chicken essence in the market. The results manifested that 28 chicken essences were found to have chicken derived components， and 2 chicken essences were not found to have chicken derived components. The designed probe and primer can specifically detect the chicken derived components in chicken essence in a short time. This method is simple， rapid， highly accurate and specific， which can provide a practical and effective method for the monitoring of chicken origin in chicken essence.

Key Words： Real-time PCR; Chicken essence seasoning; Chicken-derived ingredients

1前言

隨著人們對烹飪需求的提高，近幾年，我國固體調味品市場日漸增大，其中雞精更是受到了消費者的廣泛喜愛。雞精的產量逐年增加，2019年的產量達到43.42萬噸，其市場規模也在2019年達到44.95億元。根據我國商業標準SB/T 10371-2003《雞精調味料》，雞精的原料是雞肉/雞骨的粉末或其濃縮抽提物、味精、食用鹽、呈味核苷酸二鈉及其輔料。雞精中是否有“雞”也成為消費者關注的焦點。

PCR技術是一種分子生物技術，與色譜法、化學方法等相比較，PCR技術因其特異性強，檢測時間較短，靈敏度高，已在檢測動物源性成分中受到了廣泛應用[1-4]。實時熒光PCR是利用對PCR反應體系中的熒光信號的實時監測，實現對樣品模板的定性分析[5]。本實驗采用實時熒光PCR對雞精樣品進行檢測，旨在了解市面上雞精中雞源性成分情況。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 雞精

本次實驗中30個批次的雞精樣品（編號：1-30）均購自商超、農貿市場等。雞骨、雞肉、豬肉和牛肉均購自農貿市場。

2.1.2 引物、探針的設計和合成

設計的引物和探針序列見表1。引物和探針均由深圳華大基因合成。

2.1.3 試劑

通用基因組DNA提取試劑盒（廠家：TaKaRa 貨號：9765），Premix Ex Taq（廠家：TaKaRa 貨號：RR390）。

2.1.4 實驗儀器

實時熒光PCR系統（廠家：瑞士羅氏公司 型號：LightCycler96），微量核算蛋白分析儀（廠家：Thermo 型號：NanoDrop ONEc），恒溫水浴鍋（廠家：上海森信實驗儀器 型號：DK-8D），高速冷凍離心機（廠家：Thermo 型號：Legend Micro21R）。

2.2 方法

2.2.1 雞精中DNA的提取

按DNA提取試劑盒的說明書，對雞精樣品進行DNA提取。取20mg～25mg的雞精，置于離心管中，加入10?L的RNA酶（10mg/mL），180?L的GL緩沖液和20?L的蛋白酶K，于56℃水浴溫浴約3小時。將上述裂解液12000rpm離心2min，取上清200?L，加入1：1的無水乙醇和GB緩沖液充分吸打混勻。將混勻的液體移至安置在收集管上的吸附柱中，離心兩分鐘后，倒掉濾液。接著用WA緩沖液和WB緩沖液分別進行洗脫，并倒掉濾液。最后將洗脫后的吸附柱安置于新離心管上，用Elution Buffer（需提前預熱到65℃）洗脫DNA，得到雞精樣品的DNA。

2.2.2 雞骨、雞肉、牛肉和豬肉DNA的提取

按照DNA提取試劑盒的說明書，對雞骨、雞肉、牛肉和豬肉進行DNA提取。分別取20mg-25mg的雞骨、雞肉、牛肉和豬肉，將雞肉、豬肉和牛肉剪碎，雞骨用液氮研磨后，置于離心管中，加入10?L的RNA酶（10mg/mL），180?L的 GL緩沖液和20?L的蛋白酶K，于56℃水浴溫浴5小時。其他步驟同2.2.1 雞精中基因組DNA的提取。

2.2.3 熒光PCR檢測

反應體系配制比例見表2。

向每個實時熒光PCR反應管中加入以上反應混合液，轉移至樣品制備區。提取雞肉，雞骨中的DNA用于陽性對照，提取豬肉和牛肉中的DNA作為陰性對照，等體積的去離子水用于空白對照。分別將制備好的模板DNA溶液加入裝有反應混合液的實時熒光PCR反應管中，進行實驗。

擴增條件見表3。

3 結果與分析

3.1 模板DNA質量

將獲得的DNA提取液用微量核算蛋白分析儀測定。其OD260/280的值為1.8-2.0，能滿足實時熒光PCR的要求。

3.2 質控

為防止出現假陽性或假陰性，將豬肉和牛肉中提取的DNA作為陰性對照，雞肉和雞骨頭中提取的DNA作為陽性對照，等體積去離子水作為模板空白對照。對照組均設置2個重復，樣品組均設置3個重復。結果顯示，空白、陰性對照的2組重復均無FAM熒光信號檢出;陽性對照2組重復均有FAM熒光信號檢出，Ct值均<30.0，呈現典型的擴增曲線。

3.3 結果

經過實時熒光PCR檢測，發現30個雞精樣品中，有28個雞精樣品檢測出雞源性成分，有2個雞精樣品未檢測出雞源性成分。根據每個雞精樣品的配料表中與雞源性相關的成分的標識，未檢出雞源性的樣品分別標識了食用雞油和雞肉香精，而檢出雞源性成分的樣品則標識了雞肉粉、雞肉蛋白粉、雞肉等，見表4。

4 討論

本實驗采用的實時熒光PCR技術相比傳統PCR技術具有少污染、高通量、更便捷的優點，在雞精中雞源性的檢測具有一定的優勢。然而熒光PCR也有其局限性，容易受殘留的DNA提取試劑和加工原料的影響[6]，雞精中的成分復雜，對于熒光PCR的干擾因子也較多。本實驗以豬肉和牛肉的DNA提取物作為陰性對照，雞肉和雞骨的DNA提取物作為陽性對照，且陽性對照均為陽性，空白對照和陰性對照的結果均為陰性，說明建立的實時熒光PCR實驗是具有可信度的。本實驗對30個雞精樣品進行雞源性檢測，從實驗結果可以看出檢測的28個雞精樣品添加了含有雞源性成分的配料，且都檢出了雞源性成分。一個雞精樣品未添加雞源性成分配料，未檢測出雞源性成分。另一個雞精樣品雖然添加了食用雞油，但并未檢出雞源性成分。含有雞源性成分的配料必然會比僅添加香精的產品成本高，且現行的國家標準和行業標準并未對雞精中雞源性檢測做出規定，勢必造成某些商家為了節約成本，欺騙消費者。目前，國內關于雞精中雞源性檢測的研究較少，本實驗可為雞精質量監管提供可行的檢測鑒定參考。

參考文獻

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[2]李婷婷，張桂蘭，趙杰，朱超，王之瑩，陳愛亮.肉及肉制品摻假鑒別技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（02）：409-415.

[3]陳曉宇，陸利霞，熊雄，等.實時熒光PCR技術鑒別流通環節的摻假牛肉及其制品[J].生物加工過程，2021，19（2）：214-226.

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[5]周云龍.轉基因生物標準物質研制與應用[M].中國質檢出版社，2014：51-52.

[6]程欣.應用實時熒光PCR方法鑒別食品中的鴨源性成分[D]. 南京農業大學，2015.