膠體金免疫層析法測定山楂制品中羅丹明B

李倩 楊國偉 張燁

摘 要：目的：建立了膠體金免疫層析法快速檢定山楂制品中羅丹明B。方法：本實(shí)驗(yàn)通過逐步優(yōu)化前處理方法，使得最終前處理方法和復(fù)溶液能夠滿足檢測需要。確定了提取-凈化-濃縮-復(fù)溶的過程，將目標(biāo)物進(jìn)行了凈化和濃縮，通過肉眼觀測快速檢測卡顯色情況和液相色譜檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：膠體金免疫層析法檢出的陰性樣品、陽性樣品（5 ?g·kg-1）、陽性樣品（10 ?g·kg-1）均與液相色譜法檢測結(jié)果一致。結(jié)論：該方法可作為山楂制品中羅丹明B的膠體金免疫層析快速檢測。

關(guān)鍵詞：羅丹明B；山楂制品；前處理方法；膠體金免疫層析法

Determination of Rhodamine B in Hawthorn Products by Colloidal Gold-Based Immunochromatography

LI Qian， YANG Guowei， ZHANG Ye

（Shanxi Inspection and Testing Center Institute of Drug Inspection Technology， Taiyuan 030001， China）

Abstract： Objective： A rapid detection method of rhodamine B in hawthorn products is established by colloidal gold-based immunochromatography. Method： In this experiment， the final pretreatment method and complex solution can meet the needs of detection by gradually optimizing the pretreatment method. The process of extraction purification concentration re dissolution was determined. The target was purified and concentrated. The color development of the fast detection card was observed by naked eyes and the results of liquid chromatography were compared. Result： Negative sample， spositive samples（5 μg·kg-1）and spositive samples（10 μg·kg-1） can be detected by colloidal gold immunochromatograph and Hplc. Conclusion： This method can be used as a rapid detection rhodamine B in hawthorn products by colloidal gold immunochromatography.

Keywords： rhodamine B; hawthorn products; pretreatment; colloidal gold immunochromatography

羅丹明B，也叫花粉紅，是一種人工合成的脂溶性熒光染料，呈鮮桃紅色。通過食物鏈進(jìn)入人體后，經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化會產(chǎn)生致癌作用，我國已明確規(guī)定禁止其在食品中使用。但由于羅丹明B具有價(jià)格低廉、顏色鮮艷、著色穩(wěn)等特點(diǎn)，某些小作坊為了降低成本仍違法將其添加到食品中。為保障食品安全，需要建立快速、穩(wěn)定、成本可控的檢測方法。羅丹明B最常見的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有高效液相色譜法[1-2]、液相色譜儀質(zhì)譜/質(zhì)譜法[3]等，其中色譜法檢測食品中羅丹明B具有準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。但是樣品前處理復(fù)雜，還需要用到凝膠色譜凈化系統(tǒng)、液相、質(zhì)譜等大型檢測設(shè)備，準(zhǔn)入門檻較高，難以在基層檢測部門中開展，目前只能在少部分實(shí)驗(yàn)室中使用，也無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。

膠體金免疫層析法具有操作簡單、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、無需昂貴檢測儀器等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合高通量初篩。目前我國市場上已有數(shù)家利用此技術(shù)的商品化試劑盒，適合在快檢中推廣使用。因此，本研究選擇膠體金免疫層析技術(shù)[4-8]作為本方法的主要檢測手段。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化前處理方法，建立以膠體金免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測方法，該方法的建立為食品中羅丹明B的現(xiàn)場質(zhì)量控制提供了依據(jù)，同時(shí)也為食品樣品的大批量初篩提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

移液槍；中佳高速離心機(jī)；多管漩渦混合儀；電子天平；固相萃取小柱（中性氧化鋁柱，1 000 mg/6 mL）；深圳易瑞免疫膠體金試劑盒；正己烷、丙酮、甲醇、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為分析純。

山楂片（空白樣品），山楂條（空白樣品），均購自太原本地大型超市，經(jīng)檢測不含羅丹明B。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液的制備

稱取羅丹明B，加甲醇定容、混勻制得0.1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用新配。

1.2.2 復(fù)溶液的配制

①pH=6.8磷酸鹽緩沖液。取0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液25 mL，加0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液11.8 mL，再加水至100 mL，混勻即得。②pH=7.1磷酸鹽緩沖液。取0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液67 mL，加0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液33 mL，混勻即得。

③pH=7.4磷酸鹽緩沖液。磷酸氫二鈉1.36 g，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液79 mL，加水至200 mL，混勻即得。

1.2.3 前處理方法

取山楂制品2 g于50 mL具塞離心管中，加15 mL丙酮-正己烷（8∶2），振蕩提取3 min，以8 000 r·min-1離心2 min。上清液待凈化。將全部的上清液轉(zhuǎn)移至中性氧化鋁小柱中，并用15 mL丙酮-正己烷（8∶2）淋洗中性氧化鋁小柱，流出液全部棄去。再加入甲醇5 mL洗脫并收集洗脫液，氮?dú)獯蹈伞＞芗尤?00 ?L復(fù)溶液，渦旋混合1 min，作為待測液。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 提取試劑的選擇

考察水、磷酸鹽緩沖液、乙醇、甲醇和丙酮-正己烷（8∶2）溶液對羅丹明B的提取效果。結(jié)果表明，水溶液的提取系統(tǒng)中水、磷酸鹽緩沖液含水量高會影響中性氧化鋁小柱的活性，不適用于固相萃取小柱，不利于濃縮和富集。有機(jī)相的提取系統(tǒng)中乙醇、甲醇和丙酮屬于親水性有機(jī)溶劑，提取樣品雜質(zhì)較多。而丙酮-正己烷（8∶2）溶液具有一定的親水性又有一定比例的親脂性對羅丹明B的提取效果較好，且適用于固相萃取。故選擇丙酮-正己烷（8∶2）作為提取劑。

2.1.2 洗脫液體積的選擇

羅丹明B經(jīng)固相萃取系統(tǒng)濃縮富集后，需加入甲醇進(jìn)行洗脫，分別考察1 mL、3 mL、5 mL和10 mL體積的洗脫效率，發(fā)現(xiàn)淋洗體積超過5 mL樣品的結(jié)果趨于穩(wěn)定。考慮到時(shí)效性選擇5 mL作為洗脫體積取值。

2.1.3 高效液相色譜法測定固相萃取小柱耐用性

選擇市場上不同品牌的中性氧化鋁固相萃取小柱（規(guī)格：1 g/6 mL），進(jìn)行耐用性評價(jià)，回收率均在60%～120%，說明固相萃取小柱的耐用性良好，見表1。

2.1.4 復(fù)溶液的選擇

對比pH=6.8磷酸鹽緩沖液、pH=7.1磷酸鹽緩沖液、pH=7.4磷酸鹽緩沖液這3種溶液的點(diǎn)板效果。結(jié)果顯示pH=7.1磷酸鹽緩沖液復(fù)溶效果比較好，可以得到滿意的點(diǎn)板效果。

2.1.5 測定時(shí)間

本研究考察了復(fù)溶后0 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min測定效果。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長，待測液點(diǎn)板后T線顏色逐漸變深，不利于結(jié)果的真實(shí)判定，因此本方法建議復(fù)溶后立即測定。

2.1.6 孵育溫度

為了考察溫度對抗原抗體反應(yīng)的影響，本研究對比了18 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下的反應(yīng)效果。在上述各溫度下，30～40 ℃孵育下T線檢測結(jié)果較明顯。因此為了避免極端監(jiān)測環(huán)境對于檢測相關(guān)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，建議日常檢驗(yàn)在室內(nèi)或相對溫和的檢驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行，故本方法中孵育溫度建議為30～40 ℃。

2.2 結(jié)果判定以及測定步驟

2.2.1 結(jié)果判定

由圖1知，陽性結(jié)果：檢測線未能顯色或顏色較控制線顏色淺，表明樣品中羅丹明B檢出為陽性。陰性結(jié)果：檢測線顏色比控制線顏色深或者二者顏色一致，表明樣品中羅丹明B未檢出為陰性。

2.2.2 結(jié)果性能指標(biāo)計(jì)算

取已購空白樣品200份，分別加入0 μg·kg-1、2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1的羅丹明B，按照步驟進(jìn)行測定。由表2可知，5 μg·kg-1以上濃度均可以滿足要求，可以作為本方法的檢出限。

2.3 交叉反應(yīng)

分別取蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ、誘惑紅、胭脂紅、羅丹明6G和羅丹明123標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制成水平為20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察試劑盒與上述化合物的交叉反應(yīng)。結(jié)果表明上述化合物均無交叉反應(yīng)。

2.4 高液相色譜法測定不同基質(zhì)的加標(biāo)測定結(jié)果的一致性分析

使用高液相色譜法對20份分別添加0倍、1倍、2倍檢出限水平的空白及陽性樣品進(jìn)行檢定。由表3知，測試結(jié)果表明回收率均滿足檢測要求（回收率要求在60%～120%），即0 μg·kg-1均未檢出為陰性，5 μg·kg-1、10 μg·kg-1均可以檢出為陽性，均與本方法表2中的結(jié)果保持一致。

3 結(jié)論與討論

本文通過優(yōu)選提取試劑和復(fù)溶溶液，優(yōu)化了洗脫溶液的洗脫體積，并對常見中性氧化鋁小柱進(jìn)行耐用性評價(jià)，同時(shí)還考察測定時(shí)間、孵育溫度對實(shí)驗(yàn)的影響，使得單樣時(shí)間得以控制在1 h之內(nèi)。實(shí)際測定結(jié)果表明該方法較傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室常用的液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、酶聯(lián)免疫方法操作更加簡便快速，回收率符合要求，假陽性率較低，特異性強(qiáng)，成本低，時(shí)間較實(shí)驗(yàn)室方法大大縮減，非常適合實(shí)驗(yàn)室大批量快速篩查以及有一定實(shí)驗(yàn)操作基礎(chǔ)的基層工作人員現(xiàn)場檢測。但要注意到商品化快檢試劑盒為本方法應(yīng)用過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。建議應(yīng)用試劑盒前對其性能指標(biāo)進(jìn)行考察評價(jià)，符合方法學(xué)性能指標(biāo)和評價(jià)準(zhǔn)則各項(xiàng)要求后方可使用。此外，方法使用過程涉及樣品前處理和結(jié)果判讀等關(guān)鍵步驟，如果操作不當(dāng)將直接影響測定結(jié)果。建議對方法使用者進(jìn)行必要的培訓(xùn)。同時(shí)本方法為篩選方法，篩查出的陽性結(jié)果應(yīng)用參比方法對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的確證。

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