黃蜀葵花對碘普羅胺誘導腎小管上皮細胞損傷的作用及其機制研究*

徐中馳，劉春玲，林欣，高坤，牛茹歌

（1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫院心內科，江蘇南京 210004；3. 江蘇省中醫院腎內科，江蘇南京 210004）

造影劑腎病是指在排除其他病因的情況下，接受血管內注射造影劑后72 h 內出現腎功能損傷，血肌酐較基線水平升高≥25%或＞44 mmol/L[1]。隨著造影劑在心臟冠狀動脈介入診療領域和放射診斷技術中的廣泛應用，造影劑腎病的發病率顯著增加，已成為醫院內獲得性腎損傷的第三大主要原因[2]。既往研究表明，造影劑腎病與經皮冠狀動脈介入術后發生長期重大不良事情的風險呈正相關，包括腎衰竭和心血管事件[3]。目前對造影劑腎病的預防，尚缺乏特異性的治療方案。

黃蜀葵花是腎臟疾病常用的清利藥之一。其中黃酮類化合物是其主要活性成分[4]。現代藥理學研究證實，黃蜀葵花黃酮類化合物具有抗炎、解熱、鎮痛、抗氧化、保護腎小管和腎小球損傷等作用[5-6]。N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）是氧自由基的直接清除劑，在防治造影劑腎病中發揮重要作用。本文以NAC 為陽性藥，旨在探究黃蜀葵花總黃酮（total flavones of A.manihot,TFA）干預碘普羅胺誘導的人近端腎小管上皮細胞（human kidney-2, HK2）損傷的作用機制，為防治造影劑腎病提供新的治療手段和思路。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

HK2 細胞購自廣州賽庫生物技術有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑胎牛血清、DMEM/F12 培養基（美國Gibco 公司），活性氧（reactive oxygen species, ROS）檢測試劑盒、細胞裂解液（RIPA 裂解液）、BCA 蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、DAPI 染色液、抗熒光淬滅液（上海碧云天生物技術有限公司），碘普羅胺（碘濃度為370 mgI/mL）（德國拜耳醫藥保健有限公司），TUNEL 凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），抗ASK1 抗體、山羊抗兔IgG HRP、山羊抗鼠IgG HRP、山羊抗兔IgG Fluor488 結合物（江蘇親科生物研究中心有限公司），抗p-ASK1 抗體、抗P38 MAPK 抗體、抗磷酸P38 MAPK 抗體、抗JNK 抗體、抗磷酸SAPK/JNK 抗體、抗Caspase-3 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司），Bcl-2 抗體、Bax 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.2.2 主要儀器凝膠成像儀、電泳系統（美國Bio-Rad公司），正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），酶標儀（美國Bio Tek 公司），Forma 二氧化碳CO2培養箱（德國Thermo 公司），FACSCelesta 流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.3 黃蜀葵花總黃酮制備過程

黃蜀葵花總黃酮由江蘇省中醫院制劑科提取。中藥黃蜀葵花500 g 完全浸泡在8 000 mL 75%乙醇中1 h，將混合物加熱到90℃并持續1 h。混合物過濾后，在60℃環境中蒸發成粉狀，滅菌稱量后置于干燥環境中備用[4，7]。總黃酮在生藥中的平均含量為4.992%，標準偏差系數值為0.160%，該工藝合理，穩定可行[8]。

1.4 細胞培養及分組

將HK2細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，并放置在37℃、5%二氧化碳的恒溫培養箱中孵育。用碘普羅胺（0 mgI/mL、37 mgI/mL、74 mgI/mL、111 mgI/mL、148 mgI/mL、185 mgI/mL）和TFA（0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.6 mg/mL、1.0 mg/mL、1.4 mg/mL）孵育HK2 細胞，12 h 后檢測細胞活性，根據結果篩選出碘普羅胺誘導HK2 細胞損傷和TFA 干預細胞損傷的最佳濃度。利用TFA 干預碘普羅胺孵育的HK2 細胞，將細胞分空白組、模型組（111 mgI/mL碘普羅胺）、TFA 組（0.6 mg/mL TFA）、TFA+模型組（111 mgI/mL 碘普羅胺+0.6 mg/mL TFA）、NAC 組（10 mmol/L NAC）、NAC+ 模型組（111 mgI/mL 碘普羅胺+10 mmol/L NAC）。陽性藥NAC 濃度設置由前期實驗及相關參考文獻結果獲得[9]。

1.5 方法

1.5.1 CCK-8 法檢測細胞活性取對數生長期的HK2 細胞接種于96 孔板中，按照上述分組每孔加入100 μL 試劑孵育12 h。用無血清培養基配置10% CCK-8 工作液，每孔加入100 μL CCK-8 工作液，孵育1 h 后用光譜儀測量450 nm 波長處光密度。細胞存活率以對照的百分比表示。

1.5.2 ROS檢測試劑盒檢測ROS水平用無血清培養液稀釋DCFH-DA（1∶1 000），使終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養液，加入稀釋好的DCFH-DA，在37℃細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次，置于倒置熒光顯微鏡下進行觀察。

1.5.3 Annexin V-FITC 染色及流式細胞術檢測HK2 細胞凋亡將HK2 細胞接種于96 孔板中，各組孵育12 h 后吸除細胞培養液，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗滌，加入Annexin V-FITC 試劑和PI 試劑染色，室溫下避光靜置15 min，隨即在熒光顯微鏡下觀察。

PBS 洗滌細胞，胰蛋白酶消化3 min，加入含血清培養基終止消化。每個樣品均離心后棄上清液。加入500 μL 1×結合緩沖液使細胞懸浮，每管加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI。冰上避光孵育10 min，用FACSCelesta 流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5.4 TUNEL染色檢測HK2細胞凋亡TUNEL 染色試劑盒用于評估凋亡細胞的存在。將HK2 細胞在4%多聚甲醛中固定20 min，用0.5% Triton X-100在PBS中滲透5 min，PBS清洗。加入TUNEL染色液，37℃孵育1 h，PBS 洗滌細胞。每孔加入DAPI 染色液，黑暗中孵育5 min后去除染色液，PBS洗滌細胞，最后在正置熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。

1.5.5 Western blotting 檢測凋亡蛋白表達將HK2細胞按2.5×105個/mL 的密度接種于6 孔板中，按實驗分組提取蛋白。用BCA 試劑盒進行蛋白定量。提取的細胞蛋白裂解產物用SDS-PAGE 凝膠分離，濕轉法將蛋白轉移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，放入對應一抗，置于4℃孵育過夜，加入HRP標記的山羊抗兔或小鼠IgG 二抗，室溫孵育1 h，滴加ECL 化學發光液顯影，用Chemidoc 成像系統顯示條帶。以GAPDH 作為內對照。用Image Lab 軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.5.6 免疫熒光法檢測HK2 細胞p-ASK1 熒光表達在12 孔板內放置細胞玻片，將HK2 細胞接種于12孔板中。待細胞長滿后，按上述分組進行刺激。加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min，用0.5% Triton X-100 通透5 min，PBS 清洗，加入含5%BSA 的PBS，室溫封閉1 h，加入p-ASK1 配置的一抗，4℃孵育過夜，加入PBS 配置的熒光二抗，室溫孵育1 h，滴加DAPI 染色液10 min，抗熒光淬滅劑封片。使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 碘普羅胺誘導HK2細胞損傷

加入0 mgI/mL、37 mgI/mL、74 mgI/mL、111 mgI/mL、148 mgI/mL、185 mgI/mL 碘普羅胺的HK2 細胞活性分別為（100.00±0.00）%、（78.61±1.61）%、（56.06±2.01）%、（47.86±1.83）%、（41.56±1.15）%、（33.69±2.53）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=638.026，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：0 mgI/mL碘普羅胺的HK2 細胞活性最高（P＜0.05），加入37 mgI/mL、74 mgI/mL、111 mgI/mL、148 mgI/mL、185 mgI/mL 碘普羅胺的HK2 細胞活性依次降低（P＜0.05），表明細胞活性呈濃度依賴性降低。根據結果采用111 mgI/mL 碘普羅胺作為碘普羅胺誘導HK2細胞損傷的模型復制濃度。

2.2 TFA對HK2細胞活性的影響

加入0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.6 mg/mL、1.0 mg/mL、1.4 mg/mL TFA 的HK2 細胞活性分別為（100.22±0.27）%、（101.74±2.15）%、（103.02±1.29）%、（109.17±2.890）%、（90.82±3.47）%、（18.17±5.48）%，經方差分析，差異無統計學意義（F=1.839，P=0.143）。考慮TFA 0.6 mg/mL 時細胞活性較高，將其作為干預碘普羅胺誘導HK2 細胞損傷的最佳濃度。

2.3 氧化應激介導碘普羅胺對HK2細胞的損傷

免疫熒光法結果顯示，ROS 隨時間增加逐漸升高，表明碘普羅胺以時間依賴性的方式促進ROS的生成。見圖1。

圖1 不同時間碘普羅胺誘導HK2細胞損傷 （×200）

2.4 TFA抑制碘普羅胺誘導的HK2細胞產生ROS

免疫熒光法結果顯示，模型組綠色熒光強度高于空白組；使用TFA 和NAC 處理后熒光強度顯著降低，表明TFA 減少了碘普羅胺誘導的HK2 細胞ROS的產生。見圖2。

圖2 各組HK2細胞ROS的生成 （×200）

2.5 TFA對碘普羅胺誘導的HK2細胞損傷的保護作用

空白組、模型組、TFA 組、TFA+模型組、NAC 組、NAC+ 模型組HK2 細胞活性分別為（100.67±0.95）%、（51.07±1.09）%、（97.52±1.49）%、（74.72±2.10）%、（106.61±2.90）%、（90.73±3.98）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=311.295，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：空白組、TFA 組與NAC 組HK2細胞活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；TFA+模型組、NAC+模型組HK2 細胞活性高于模型組（P＜0.05），提示TFA 對碘普羅胺誘導的HK2 細胞損傷有保護作用。

2.6 TFA 對碘普羅胺誘導的HK2 細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC 及TUNEL 染色結果顯示，與空白組比較，模型組熒光強度明顯增高；TFA 組、NAC 組與空白組比較無明顯差異；與模型組比較，TFA+模型組和NAC+模型組細胞熒光強度降低（見圖3、4）。其結果與流式細胞術結果一致（見圖5）。

圖3 TFA干預碘普羅胺誘導的HK2細胞凋亡 （Annexin V-FITC染色×200）

圖4 TFA干預碘普羅胺誘導的HK2細胞凋亡 （TUNEL染色×400）

圖5 各組HK2細胞的流式細胞術結果

Western blotting 檢測結果表明，空白組、模型組、TFA 組、TFA+模型組、NAC 組、NAC+模型各組Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3/Caspase-3 蛋白比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與空白組比較，模型組Bcl-2/Bax 蛋白表達降低（P＜0.05），Cleaved caspase-3/Caspase-3 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，TFA+模型組和NAC+模型組Bcl-2/Bax 蛋白表達升高（P＜0.05），Cleaved caspase-3/Caspase-3 蛋白表達降低（P＜0.05），表明TFA 減少了碘普羅胺誘導的HK2 細胞凋亡。見表1和圖6。

圖6 各組HK2細胞凋亡蛋白的表達

表1 各組HK2細胞凋亡蛋白相對表達量比較 （±s）

表1 各組HK2細胞凋亡蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別空白組模型組TFA組TFA+模型組NAC組NAC+模型組F 值P 值pJNK/JNK蛋白1.017±0.030 3.944±0.256①1.532±0.274 1.801±0.440②1.262±0.178 1.697±0.487②32.520 0.000 Bcl-2/Bax蛋白1.386±0.125 0.454±0.155①1.380±0.053 1.217±0.058②1.381±0.269 1.215±0.315②10.805 0.000 Cleaved caspase-3/Caspase-3蛋白1.044±0.023 2.630±0.487①1.073±0.194 0.928±0.283②0.830±0.186 0.830±0.152②20.976 0.000 pP38/P38蛋白0.854±0.219 2.123±0.404①0.912±0.104 0.935±0.085②0.802±0.048 0.966±0.128②18.510 0.000

2.7 TFA 通過干預ASK1-MAPKs 減少碘普羅胺誘導的HK2細胞凋亡

免疫熒光法結果表明，與空白組比較，模型組p-ASK1 熒光表達明顯增強；TFA 組、NAC 組與空白組比較，熒光表達無明顯差異；TFA+模型組、NAC+模型組的p-ASK1 熒光強度較模型組減弱。見圖7。

圖7 各組HK2細胞p-ASK1熒光表達 （免疫熒光法×400）

Western blotting 檢測結果表明，空白組、模型組、TFA 組、TFA+模型組、NAC 組、NAC+模型組pP38/P38、pJNK/JNK 蛋白比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與空白組比較，模型組pP38/P38、pJNK/JNK 蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，TFA+模型組和NAC+模型組pP38/P38、pJNK/JNK 蛋白表達降低（P＜0.05），提示TFA 干預碘普羅胺誘導的HK2 細胞凋亡與抑制ASK1-MAPKs 通路有關。見表1和圖6。

3 討論

造影劑腎病的發病機制尚未完全闡明，目前認為造影劑腎病是腎血管和腎小管相互作用的結果，氧化應激和炎癥是其主要病理生理機制[10]。造影劑會引起滲透性利尿，增加液體的排出，使腎小管重吸收增加，增加氧耗，加重髓質的缺血缺氧[11]。有研究結果表明，ROS 在造影劑引起的腎損害中發揮重要作用[12]。缺氧會促進ROS 的產生，ROS 促進腎臟氧化應激，誘導細胞凋亡，導致腎小管細胞損傷[9,13]。

ASK1 是MAP3Ks 家族成員之一[14]。多種應激損傷可以激活ASK1。ASK1 響應各種壓力，如氧化應激、鈣超載、炎癥信號等[15]，在凋亡、壞死、炎癥和纖維化中發揮重要作用[16]。ROS 誘導的細胞凋亡是ASK1 依賴性的[17]。越來越多的證據表明，ROSASK1 信號通路廣泛參與細胞凋亡過程[18-20]。ASK1激活JNK 和P38 MAPK，在細胞因子和應激誘導的細胞凋亡中構成一個關鍵的信號通路，主要通過線粒體依賴的Caspase 激活來執行凋亡，并受到Bcl-2 家族成員在內的不同凋亡信號機制的嚴格調控[21-22]。造影劑誘導ROS 過量產生，通過ASK1-MAPKs 途徑激活Caspase-3，破壞HK2 線粒體酶活性，誘導線粒體膜電位下降，最終導致細胞凋亡[23]。

黃蜀葵花為錦葵科黃蜀葵的干燥花冠，其性甘、寒，歸腎、膀胱經，具有清利濕熱、消腫解毒功效。高效液相色譜分析鑒定出黃蜀葵花有蘆丁、金絲桃苷、楊梅素、槲皮素等多種黃酮類化合物。臨床研究顯示，黃蜀葵花及其制劑能防治造影劑腎病[24-26]。ROS 過量生成可誘發氧化應激，提示預防性使用抗氧化劑可干預造影劑腎病。

本研究結果顯示，碘普羅胺孵育的HK2 細胞ROS 呈時間依賴性升高，細胞活性明顯降低。Annexin V-FITC 和TUNEL 染色、流式細胞術檢測結果顯示碘普羅胺誘導HK2 細胞凋亡，Bcl-2、Bax 及Cleaved caspase-3 蛋白表達也支持該結果。TFA 干預后，上述現象都顯著減少，其結果與陽性藥NAC干預趨勢相同，提示TFA 減輕碘普羅胺誘導的HK2細胞凋亡。其次，本研究還發現TFA 可降低p-ASK1熒光表達，并下調P38、JNK 蛋白磷酸化表達水平，表明TFA 干預碘普羅胺誘導的HK2 細胞凋亡可能與抑制ROS-ASK1-MAPKs 信號通路有關。

綜上所述，黃蜀葵花可以減少碘普羅胺誘導的HK2 細胞凋亡，其機制可能與黃蜀葵花抑制ROSASK1-MAPKs 信號通路激活有關。