豬場口蹄疫O 型病毒抗體檢測與分析

谷冉坤，張秀衛，賈亞淼，甄江

（1.趙縣動物疫病預防控制中心，河北 趙縣 051530； 2.石家莊市農業綜合行政執法支隊，河北 石家莊 050000）

我國將口蹄疫病列入一類動物疫病首位，對所有養殖場實行強制免疫口蹄疫疫苗的政策，要求免疫群體免疫密度常年保持90%以上，免疫抗體合格率常年保持在80%以上。 為切實了解豬場口蹄疫抗體水平，科學評價口蹄疫疫苗免疫效果，我疫控中心在3 個豬場采集血清，用豬口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體酶聯免疫吸附試驗的方法檢測口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體，對免疫結果進行評價，為今后我縣豬口蹄疫的防治研究提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗豬場

隨機選擇3 個豬場做實驗， 分別用A、B、C場表示，3 個豬場均為自繁自養， 全進全出的飼養方式。 A 場存欄800 頭、B 場存欄1500 頭，C場存欄1200 頭。

1.2 疫苗接種情況

3 個豬場使用的疫苗均為申聯生物 （上海）股份有限公司生產的豬口蹄疫O 型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）， 一瓶50 毫升， 批號20210104，按照疫苗說明書要求，三個豬場獸醫均在2021 年4 月份對豬場40 日齡以上的健康豬肌肉注射1 毫升該疫苗，間隔1 個月后再次注射1 毫升，病豬、瘦弱、懷孕后期及斷奶前的仔豬沒有接種，接種后豬只未出現過敏反應。

1.3 檢測方法

用豬口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體酶聯免疫吸附試驗的方法檢測口蹄疫O 型病毒抗體，檢測試劑盒為鄭州中道生物技術有限公司生產，檢測時間為2021 年10 月份。

2 樣品前處理

隨機采集3 個豬場免疫豬的全血， 采集A場血樣30 份，B 場30 份、C 場30 份，共90 份血樣，用高速離心機分離出血清，血清清亮無溶血，對血清樣品進行編號，A 場樣品編號1-30 號，B場樣品編號31-60 號，C 場樣品編號61-90 號。

3 實驗儀器設備及試劑

3.1 儀器設備：100 毫升量筒、500 毫升燒杯，離心管架、電熱恒溫培養箱、微型振蕩器、酶標分析儀、洗板機、1.5 毫升離心管、純化水、0.5～10 微升、10～100 微升和100～1000 微升單道移液器、30～300 微升的多道移液器、不同型號的吸頭、玻璃棒、移液槽等。

3.2 實驗試劑為鄭州中道生物技術有限公司生產的豬口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體酶聯免疫吸附試驗診斷試劑盒，批號：20210701，用于檢測豬血清中的口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體，適用于評估豬口蹄疫合成肽疫苗免疫狀況，2℃～8℃保存。

3.3 試劑盒組成

3.3.1 抗原包被反應板96T×2 包

3.3.2 陰性對照血清1.5 毫升×1 瓶

3.3.3 陽性對照血清1.5 毫升×1 瓶

3.3.4 樣品稀釋液50 毫升×1 瓶

3.3.5 酶標記結合物21 毫升×1 瓶

3.3.6 顯色劑A 11 毫升×1 瓶

3.3.7 顯色劑B 11 毫升×1 瓶

3.3.8 終止液11 毫升×1 瓶

3.3.9 濃縮洗滌液（20×）50 毫升×1 瓶

3.3.10 說明書1 份

3.3.11 自封袋2 個

3.3.12 封板膜6 張

3.3.13 96T 稀釋板2 個

4 檢驗原理

微孔板上包被的人工合成的豬口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白多肽， 可與待測樣品中的特異性抗體（抗-FMDV-VPI）反應，形成抗原-抗體復合物被吸附到固相上， 再加入酶標記的抗豬IgG，則形成“固相豬口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗原-豬口蹄疫O 型病毒VPI 抗體-抗豬抗體-HRP”免疫復合物，洗滌后，如待測樣品中含有豬口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體， 加入顯色劑即顯色，為陽性，反之為陰性。

5 檢驗方法

5.1 實驗前準備： 提前2 小時從冰箱取出所用試劑恢復至室溫，放置1 小時以上，使用前充分搖勻，實驗完畢后放回2℃～8℃保存。

5.2 配洗滌液：將濃縮洗滌液（20×）用純化水進行20 倍稀釋，用量筒準確量取10 毫升濃縮洗液加入到盛有190 毫升純化水的燒杯中，用玻璃棒輕輕攪拌均勻后備用。

5.3 編號：在包被板上設陰性對照2 孔，陽性對照2 孔，其余為待檢樣品孔。

5.4 待檢樣品預稀釋：按照編號在稀釋板的各待檢樣品孔中將待檢樣品進行1∶32 稀釋，取5微升待檢血清樣品加入到155 微升樣品稀釋液中，稀釋每個樣品時必須使用不同的吸頭。 陰性對照和陽性對照不進行預稀釋。

5.5 加樣和溫育： 取出抗原包被反應板，分別從稀釋板上取稀釋后的待檢血清100 微升，陰性對照孔加入陰性對照血清100 微升，陽性對照孔加入陽性對照血清100 微升。 貼上封板膜，放37℃恒溫箱中溫育30 分鐘。

5.6 洗板機洗板： 按洗板機操作說明洗板5次。

5.7 加酶標結合物: 在抗原包被反應板各孔中加入酶標結合物100 微升。 貼上封板膜，放37℃恒溫箱中溫育30 分鐘。

5.8 洗板機洗板： 按洗板機操作說明洗板5次。

5.9 加顯色劑：每孔加入顯色劑A 50 微升，全部加完后再在每孔加入顯色劑B 50 微升，混勻。 放37℃恒溫箱中顯色10 分鐘。

5.10 終止：顯色完畢后立即于每孔加50 微升終止液，混勻。

5.11 測定： 用酶標儀在450 納米波長處測定吸光值。

6 結果判定標準

6.1 試驗成立條件： 陰性對照平均OD 值應≤0.2，每個陽性對照孔OD 值應≥0.5，否則試驗無效。

6.2 試劑盒臨界值（Cut Off 值）= 0.23×陽性對照孔平均OD 值，若陽性對照孔平均OD 值≤2.0， 則按實際值計算， 若陽性對照孔平均OD值＞2.0，則按2.0 計算。

6.3 若待檢樣品孔OD 值＜Cut Off 值， 判為陰性， 即為抗口蹄疫病毒VPI 結構蛋白抗體陰性。若待檢樣品孔OD 值≥Cut Off 值，判為陽性，即為抗口蹄疫病毒VPI 結構蛋白抗體陽性。

7 檢測結果與分析

90 份樣品均按上訴步驟進行檢測， 陰性對照平均OD 值為0.182＜0.2，2 個陽性對照孔OD值分別為0.689、0.692,均＞0.5，此次試驗成立。根據檢測結果判定標準， 分析待檢樣品孔OD 值，判斷得出以下結果：

檢測結果顯示：3 個豬場的血清樣品口蹄疫0 型病毒VPI 結構蛋白抗體合格率分別86.66%、93.33%、83.33%， 均超過了國家規定的抗體合格率在80%以上的標準，免疫效果很好。

樣品口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體結果匯總表

8 結論

8.1 通過檢測3 個豬場的口蹄疫O 型病毒VPI 結構蛋白抗體， 個體抗體合格率都比較高，均超過了國家規定的大于80%的標準， 群體免疫合格率100%，整體免疫效果很好。 免疫1 次，間隔1 個月再免疫1 次豬口蹄疫O 型合成肽疫苗，豬機體即可產生較高的抗體水平，抗體持續時間達到6 個月以上，說明豬免疫接種口蹄疫合成肽疫苗是預防豬口蹄疫發生的最有效手段。

8.2 今后繼續貫徹落實國家強制免疫口蹄疫疫苗的政策， 做到所有養殖場免疫全覆蓋，免疫密度達到100%。養殖場必須建立健全防疫制度， 重視生物安全管理，加強消毒滅源，規范引種，堅持自繁自養、全進全出的飼養模式，采取綜合防控措施，控制口蹄疫的發生。動物疫病預防控制機構要加大對口蹄疫抗體檢測力度，增加抽樣檢測點，及時匯總、分析動物疫情和監測流調信息，定期組織專家開展分析研判和風險預警，監測發現口蹄疫強制免疫抗體合格率不達標、免疫失敗的群體，按照有關免疫規定督促養殖場戶及時補免，為縣域口蹄疫防控決策提供技術支持。