超高效液相串聯質譜法檢測飼料中氯化膽堿含量

馬愛平，張忠一，★，王愛卿，劉嵩，韓新安

（1.滄州市農產品質量安全中心，河北 滄州 061000；2.河北省獸藥飼料工作總站，河北 石家莊 050035）

氯化膽堿作為一種飼料添加劑， 對于動物來說，可預防動物肝臟、腎臟中的脂肪積累及其組織變性，可促進氨基酸的再組合，可以用來加快動物的生長過程， 確保動物的脂肪新陳代謝和神經功能正常，對于人類來說，可以提高氨基酸利用率，尤其是蛋氨酸在體內的利用率；幫助脂肪維持液態形式， 并防止不需要的膽固醇或脂肪積聚在動脈、 肝臟和膀胱中。 對于植物來說， 可以促進植物光合作用， 可用作飼料添加劑，對增加產量有明顯的效果。 常用作甘薯生根劑和塊根增大劑，比如用于玉米、馬鈴薯、蘿卜、洋蔥等增加產量，并廣泛用于果樹[1]。 目前常用的氯化膽堿測定方法有高氯酸非水滴定法、銀量法、定氮法、四苯硼鈉法、雷氏鹽法[2,3,4,5]和離子色譜法[6]等。 前5 種方法均是采用化學法間接測定氯化膽堿, 方法選擇性差, 干擾因素多； 檢測飼料中氯化膽堿的國標方法有預混料中氯化膽堿的測定[6]， 采用的仲裁方法為離子色譜檢測法。

氯化膽堿化學式為C5H14ClNO，為白色的結晶粉末，極易吸濕。 熔點305℃，易溶于水和醇類，在堿性溶液中不穩定，在甲酸水溶液中會解離為C5H14NO+離子和Cl-離子，如圖1 所示：

圖1 氯化膽堿分子結構

本試驗根據氯化膽堿的性質， 對前處理步驟和儀器方法進行創新。 采取水溶液提取，C18色譜柱分離，達到快速準確，高效低耗的試驗目的，可以作為有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Waters UPLC Xevo TQ 超高效液相串聯質譜儀（美國沃特世公司）、色譜柱：BEH C18（50 毫米×內徑2.1，粒徑1.7 微米）、北京永光明DZKW-D-2 電熱恒溫水浴鍋、 德國IKA KS501振蕩混勻器、100 毫升容量瓶， 梅特勒-托利多TLE204 天平（萬分之一）、粉碎機。

試劑：乙腈（色譜純）、甲酸銨（色譜純）、水（應符合GB/T 6682 一級水指標）。

標準品：氯化膽堿(農業農村部環境質量測試中心， 含量≥95%)， 稱取氯化膽堿標準品0.1005g，置于100 毫升容量瓶中，用水溶解稀釋至刻度，搖勻，濃度為1 毫克/毫升。

1.2 樣品處理

飼料樣品用粉碎機粉碎， 通過0.42 毫米孔篩。 稱取1 克樣品（精確到0.0001 克），置于100毫升容量瓶中，加入約60 毫升水，在70℃的水浴鍋中加熱20 分鐘， 轉至振蕩器立即振蕩10分鐘，冷卻至室溫，用水定容至容量瓶刻度線，搖勻后過濾， 用初始流動相逐級稀釋至適當濃度，過0.22 微米水系濾膜，上機測定。

1.3 液相條件

柱溫：40℃，進樣室溫度：20℃，流速0.3 毫升/分鐘，進樣量1 微升，流動相A：乙腈；流動相B：2 毫摩爾/升甲酸銨水溶液。液相梯度設置見表1。

表1 液相梯度設置表

1.4 質譜條件

電離模式：ESI+；掃描方式：MRM；離子源溫度150℃，脫溶劑溫度450℃，毛細管電壓0.5 千伏，錐孔電壓30 伏，碰撞能量15 電子伏特，碰撞氣為氬氣，流速50 升/小時，脫溶劑氣為氮氣，流速900 升/小時。

1.5 結果計算

上機測定后，根據外標峰面積法定量。

氯化膽堿含量計算公式：

式中：

X——試樣中氯化膽堿的含量， 單位為毫克/千克

C——上機溶液的濃度，單位為納克/毫升

V——定容試樣總體積，單位為毫升

n——過濾后溶液的稀釋倍數

m——稱量試樣的總質量，單位為克

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

根據氯化膽堿的性質， 質譜采用正離子監測模式，選取C5H14NO+為母離子，分別對毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和離子對等質譜參數進行了優化，在子離子掃描狀態下，選取碰撞后響應最高的子離子為定量子離子， 次高的離子為定性子離子。 確定母離子104.1，定量子離子60.1，定性子離子45.0。

2.2 色譜條件的優化

色譜條件的優化主要考慮以下幾個方面。

一是選擇最常用的C18 反相色譜柱， 雖然其對極性較強的化合物保留時間較短， 但是經過試驗發現，其能夠滿足實驗要求，且能夠縮短液相方法的時間。

二是流動相的選擇，考察以下幾個方面。

考察了水相中是否加入甲酸銨的區別。 上機溶液為1 納克/毫升時， 若水相中未加入甲酸銨，104.1>45.0 離子對峰型較差， 所以選擇水相中加入甲酸銨，濃度為2 毫摩爾/升。

考察了水中是否加入1‰甲酸的區別。一般高效液相色譜串聯質譜檢測時會在水相中加入甲酸，利于維持樣品在流動相中的電離狀態，可以改善峰形。 但經過實際對比實驗，水相中不加甲酸氯化膽堿信噪比明顯升高。 因此采用了水相中不加甲酸的方法。

考察了甲醇-水、 乙腈-水兩種常見流動相體系對目標化合物的影響。 在甲醇體系中初始有機相比例分別在2%、10%、20%、30%、40%的情況進行了對比實驗。 發現隨著有機相比例的升高，氯化膽堿響應值逐漸增高，信噪比未有明顯改善（見表2）。

表2 甲醇-水體系中不同比例有機相對氯化膽堿檢測的影響

在乙腈體系流動相中，發現相比甲醇體系，乙腈體系中氯化膽堿峰高也隨著有機相比例的提高而增高，信噪比明顯改善（見表3）。

表3 乙腈-水體系中不同比例有機相對氯化膽堿檢測的影響

綜合考慮，決定選擇乙腈體系，出峰時的有機相比例選擇40%（見圖2）。

圖2 乙腈體系有機相比例為40%時離子色譜圖（1ng/毫升）

2.3 前處理條件的優化

氯化膽堿易溶于水，熔點305℃，遇熱不易分解。 因此前處理時直接用水提取，使用水浴加熱提高溶解度，震蕩促進氯化膽堿溶解，飼料中雜質較多，使用定容后過濾的方法凈化，過濾時注意防止沉淀堵塞濾紙，必要時可更換新的濾紙過濾。

2.4 線性范圍和定量限

配制2、5、10、20、50 納克/毫升濃度基質標準溶液，經上機測定，保留時間為0.43 分鐘、 標準曲線線性方程為y=856.956x+62.9086、相關系數r 為0.999739、 定量限為0.0001毫克/千克。 線性范圍能夠滿足檢測要求， 定量限遠低于國家標準方法定量限。

2.5 加標回收率和精密度

分別選取肉仔雞前期配合飼料、仔豬濃縮飼料、南美白對蝦配合飼料三種飼料進行檢測， 所得數值為樣品含量； 在樣品中添加前述濃度為1 毫克/毫升的氯化膽堿標準溶液0.5 毫升， 按照前處理步驟檢測，所得數值為樣品添加含量。 重復平行測定6 次得出相對標準偏差和平均回收率，從表4 可以看出，試驗重復性和回收率均取得較好效果。

表4 加標回收率和RSD%

3 結論

實驗建立了利用高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中氯化膽堿的檢測方法，該方法通過比較不同流動相對檢測結果的影響， 優化質譜參數， 可以快速簡便地測定配合飼料和濃縮飼料中氯化膽堿的含量，定量準確，回收率滿足分析要求。 本方法具有重復實驗數據穩定、線性關系良好、定量限遠低于國家標準的優點，適合于配合飼料和濃縮飼料的快速檢測， 也為飼料添加劑氯化膽堿檢測提供了新方法。