蜂蜜中磺胺類藥物殘留分析

李 琳

（河北通標檢測技術(shù)有限公司，河北石家莊 050000）

隨著社會的發(fā)展，食品中重金屬超標、農(nóng)藥、獸藥和激素殘留及帶有致病菌等問題已引起人們的廣泛關(guān)注。其中，獸藥殘留問題較為嚴重[1]。隨著抗生素的應用越來越廣泛，且用量較大，帶來嚴重的獸藥殘留問題。近年來，磺胺類藥物殘留超標現(xiàn)象較嚴重，主要發(fā)生在豬肉、牛肉中。目前，磺胺類殘留的檢測方法較多，但這些方法對檢測儀器要求較高，且價格昂貴，適用范圍受到局限[2]。因此，建立一種方便快捷、適用性廣、靈敏度高及檢出限低的方法很有必要。本文通過基體固相擴散（Matrix Solid-phase Dispersion，MSPD）和固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）的前處理方法對樣品進行凈化，用FMOC-Cl衍生，通過高效液相色譜-紫外法（High Performance Liquid Chromatography-ultraviolet Detection，HPLC-UV）同時檢測多種脂溶性和水溶性的磺胺類獸藥殘留。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

二氯甲烷；三氯甲烷；乙酸乙酯；正己烷；甲醇；無水乙醇；無水醋酸鈉；冰醋酸；衍生試劑；硅膠；固定相C18（Celite545）；蜂蜜，包括荊花蜜（野生）、油菜花蜜（野生）、紫云英蜜（汪氏）、萬花蜜（汪氏）和荊花蜜（百花牌）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀；色譜工作臺；檢測器（UV，Waters 2487 Dual）；色譜柱（Inersil DDS-3）；氮氣吹干裝置；可控水浴裝置；電子精密天平；101A-1型干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

（1）標準儲備液的配制。稱取標準品磺胺吡啶（Sulphapyridine，SP）、磺胺嘧啶（Sulphadiazine，SD）、磺胺二甲嘧啶（Sulphamethazine，SM2）、磺 胺 甲 嘧 啶（Sulphamerazine，SDM）、 磺 胺 -6-甲 氧 嘧 啶（Sulphamonomethoxine，SMM）、 磺胺 -5-甲 氧 嘧 啶（Sulphameter，SME）、 磺 胺 氯噠嗪（Sulphachloropyridazine，SCP）和磺胺甲惡唑（Sulphamethoxazole，SMZ）各 10.00 mg溶于 10 mL甲醇中，得到l mg/mL的標準樣品溶液Ⅰ。量取標準樣品溶液Ⅰ 100 μL，定容至10 mL，得到10 μg/mL的標準樣品溶液Ⅱ。量取標準樣品溶液Ⅱ l mL，定容至5 mL，得到2 μg/mL的標準樣品溶液Ⅲ。

（2）FMOC-C1衍生試劑配制。稱取157.9 mg FMOC-Cl用3 mL乙腈稀釋，得到0.20 mol/L衍生試劑Ⅰ。量取250 μL衍生試劑Ⅰ，定容至1 mL，得到0.05 mol/L衍生試劑Ⅱ。

（3）流動相緩沖液的配制。稱取0.820 3 g無水醋酸鈉溶于1 000 mL水中，用醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.20。

（4）硼酸緩沖液的配制。稱取1.236 3 g硼酸溶于10 mL水中配成0.2 mol/L硼酸溶液，用飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。

1.2.2 樣品預處理

用基體固相擴散法凈化樣品。稱取1.0 g蜂蜜與3.0 g C18混合后加入100 μL標準樣品溶液Ⅲ，在研缽中磨勻，晾干，裝柱。C18柱用15 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，用10 mL乙酸乙酯洗脫，收集并吹干洗脫液。

1.2.3 衍生化反應

洗脫液吹干后，加入 100 μL 甲醇和 100 μL（pH=8.0）衍生試劑FMOC-C（l0.05 mol/L），充分振蕩，25 ℃條件下反應 420 min。

1.2.4 SPE凈化

衍生完畢，用氮氣吹干多余的試劑，用1 mL二氯甲烷溶解后充分振蕩。取1.0 g硅膠表柱后，依次用10 mL甲醇，10 mL一氯甲烷活化[3]。將振蕩后的樣品加入活化后的硅膠柱后依次用10 mL 二氯甲烷、10 mL氯仿淋洗；用8 mL含25%甲醇（體積百分含量）的二氯甲烷溶液洗脫，收集并吹干洗脫液，用400 μL流動相溶解，過濾，待上機分析。

1.2.5 儀器條件

紫外檢測器的檢測波長為263 nm；色譜條件：色譜柱為Inersil ODS 3，選擇流動相A為NaOAc-HOAc緩沖體系，pH=4.20；流動相B為乙腈；流速為1.0 mL/min；進樣量20 μL；二元梯度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 多組分分離的色譜條件

根據(jù)待測樣品的衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息和紫外光譜特征，同時考慮到多種化合物同時檢測，選擇紫外檢測器的檢測波長為263 nm[4]。高效液相色譜的二元流動相A為pH=4.20的NaOAc-HOAc緩沖體系，B為乙腈，流動相流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL。在試驗多種流動相比例后，初步確定流動相A（醋酸緩沖液）∶B（乙腈）為45∶55（V/V），在此比例下，分離效果較好。但因?qū)嶒灂r間較長，為縮短實驗時間采用二元流動相梯度洗脫，對9種磺胺類藥物的FMOC-衍生物進行分離，見表1。

表1 高效液相色譜二元梯度洗脫條件

圖1是標準樣品混合溶液經(jīng)衍生后的液相色譜分離譜圖，9種藥物在26 min內(nèi)全部出峰，且分離度良好。但衍生試劑的水解峰（FMOC-OH）較明顯，待測樣品濃度較低時可能會造成干擾，需要考慮去除。

圖1 標準樣品的高效液相色譜分離譜圖（各組分濃度均為200 μg/L）

2.2 基體固相擴散對蜂蜜樣品進行凈化條件的優(yōu)化

將樣品磨碎后與固定相在物理上混合均勻，使樣品中的待分析組分不經(jīng)過任何提取操作就可以完全地、均勻地結(jié)合在固定相的表面，可大大簡化分析步驟、縮短分析時間[5]。根據(jù)不同組分與固定相的結(jié)合力的種類及大小的不同，選用不同的溶劑對固定相進行淋洗，即可將不同的組分逐一洗脫出來。

分別用正己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和甲醇對樣品進行洗脫，發(fā)現(xiàn)正己烷能將雜質(zhì)洗脫但不會將分析物洗脫；二氯甲烷和氯仿能將雜質(zhì)洗脫并能將部分分析物洗脫；乙酸乙酯可將大部分分析物洗脫且洗脫的雜質(zhì)較少，甲醇能將分析物和雜質(zhì)都洗脫下來。淋洗的主要目的是將雜質(zhì)洗掉，但要保證分析物保留在柱子里，盡量減少分析物的損失。因此，最終選擇正己烷作為淋洗液。選擇洗脫液的基本條件是將分析物盡可能的洗脫下來，使雜質(zhì)仍保留在柱中。因此，選擇乙酸乙酯作為洗脫液。

2.3 檢出限

將磺胺類藥品各組分含量為100 μg/L的標準樣品稀釋為 4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、25 μg/L和50 μg/L，經(jīng)衍生反應、SPE凈化后進行測定。加標量為4～6 μg/L時，由于雜質(zhì)峰的干擾，對峰面積的準確積分造成了影響。因此，該方法測定蜂蜜中9種磺胺類藥物殘留的檢出限為4～6 μg/kg。

2.4 加標回收率及精密度試驗

選取荊花蜜（野生）作為樣本，設(shè)置10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 和 250 μg/kg 5 個加標量。按照優(yōu)化后的實驗條件，稱取1.0 g荊花蜜（野生），分別加入不同量標準樣品后經(jīng)基體固相擴散，衍生化反應，SPE凈化后用高效液相色譜-紫外法進行測定。表2、表3結(jié)果表明，加標量在50～250 μg/kg時9種磺胺類藥物回收率為77.4%～105.1%，相對標準偏差為5.7%～11.5%，試驗的回收率和穩(wěn)定性均較好。加標濃度為10～25 μg/kg時，回收率有不同程度的下降，為63.1%～81.4%，相對標準偏差為7.5%～15.2%。痕量分析回收率大于60%、相對標準偏差小于30%時符合藥物殘留分析的國際通用標準。

表2 加標回收率試驗結(jié)果（單位：%）

表3 精密度試驗結(jié)果（單位：%）

3 結(jié)論

本文采用基體固相擴散和固相萃取相結(jié)合的技術(shù)對蜂蜜中磺胺類殘留進行了提取和凈化，建立了高效液相色譜-紫外法檢測蜂蜜中磺胺類藥物殘留量的方法。該方法對蜂蜜的加標回收率為63.1%～105.1%，相對標準偏差為5.7%～15.2%，最低檢出限為4～6 μg/kg。因此，該方法具有檢出限低、回收率高、重復性好、靈敏度高和適用性廣等優(yōu)點，可用于蜂蜜中磺胺類藥物殘留的分析檢測。